Estimation du bruit de fond

Nous avons plusieurs méthodes pour estimer le fond de l'image. Cette hétérogénéité vient du fait que le faisceau laser ne couvre pas la zone d'observation de façon uniforme. Les uoro- phores sont plus excités et émettent plus au centre de l'image mais le bruit de fond, provenant de la uorescence résiduelle du verre ou encore d'impuretés, dépend également de l'excitation (plus forte au centre).

Estimation du fond par interpolation gaussienne :

Une méthode simple pour estimer l'intensité d'excitation est d'interpoler l'image par une gaussienne à deux dimensions. La présence de points, s'il n'y en a pas trop (moins de 2000), ne nuit pas à l'interpolation ce qui permet d'obtenir une gaussienne de taille ca- ractéristique 100 à 200 pixels (correspondant à la zone d'excitation du laser). Cependant, cette méthode n'est vraiment ecace que pour un faisceau parfaitement gaussien. Dans notre cas, le prol du faisceau est susamment diérent d'une gaussienne pour que cette méthode ne soit pas la plus ecace.

3.2 Détection des particules 57

Estimation du fond par moyenne locale :

Nous préférons ltrer l'image en moyennant les pixels avec leur voisinage ce qui ne modi- e pas sensiblement les valeurs du fond mais dilue celles des uorophores en les rendant négligeables. La gure 3.3 A montre l'image 3.2 dont les pixels ont été moyennés sur un carré de côté sept pixels.1 _{Cela donne une impression de pointillisme mais l'échelle de}

niveaux de gris est bien moins grande que sur l'image initiale. Les petites taches claires ne présentent donc qu'une variation d'intensité négligeable avec leur voisinage même si cette variation est visible à l'÷il avec l'échelle de niveaux de gris choisie. Cela dessine une carte donnant une bonne approximation de l'intensité d'excitation laser. La gure 3.3 B montre le résultat après une convolution par une gaussienne de largeur 50 pixels (application d'un ou). Il s'agit de faire une moyenne de chaque pixel avec ses voisins en pondérant par une gaussienne centrée sur ce pixel. Le résultat est moins haché mais on perd un peu de contraste entre les valeurs extrêmes. De plus, la durée du traitement informatique des images est plus courte avec une simple moyenne sur un voisinage de taille raisonnable (ce temps de traitement est proportionnel à l'aire du voisinage). Estimation du fond par rolling-ball :

Le principe est de considérer l'image comme une surface sous laquelle passerait une sphère d'un rayon donné. La sphère serait incapable d'entrer dans les pics correspondants aux uorophores. Le volume couvert par la sphère est alors considéré comme un fond dont les variations spatiales sont lentes et qui peut être retranché. La gure 3.4 illustre ce principe en 1D. Nous utilisons l'équation (3.3) pour retrancher ce fond :

vn= vn− maxi∈Vn(minj∈Vi(vj)) (3.3)

où, avec k ∈ {n, i, j}, vk est la valeur du pixel k et Vk est le voisinage du pixel k (dans

notre cas il s'agit des pixels situés à une distance inférieure à deux du pixel k, soit un cercle de diamètre 5 pixels).

Cette méthode permet comme la précédente d'estimer un fond dont la forme n'est pas connue. Deux diérences sont toutefois à noter : le fond obtenu avec un rolling-ball tend à suivre les minimums d'intensité tandis que le moyennage par convolution tend natu- rellement à donner la moyenne du fond. L'écart entre les deux est donc de l'ordre de

1. Cela peut être décrit mathématiquement par une convolution de l'image avec une fonction porte 2D de largeur sept pixels.

A B

Figure 3.3  A : Approximation de l'intensité d'excitation par moyenne sur un voisinage de 49 pixels. Ce type d'image sut à approximer le niveau d'excitation pour pouvoir étudier les particules en tenant compte de leur position dans l'image. B : Forme de l'excitation laser obtenue par ltrage gaussien (largeur du ltre : 50 pixels). On ne devine plus la présence de particules mais les valeurs entre le centre et les bords sont moins contrastées. Dans les deux cas, le contraste est plus marqué que sur l'image brute 3.2 car les particules étant lissées, il n'y a plus de grandes valeurs d'intensités ce qui permet d'étaler de légères variations d'intensité sur plus de niveaux de gris.

grandeur des uctuations locales du fond.

L'autre diérence est la prise en compte des points de forte intensité (les uorophores). La méthode de rolling-ball est censée ignorer ces variations rapides d'intensité si ce n'est une diminution du nombre de minima locaux ayant des chances d'augmenter très légèrement la valeur du fond près des uorophores. La méthode de moyennage prend en compte toute l'intensité des uorophores en la diluant dans son voisinage. Le fond est alors quelque peu augmenté aux alentours des uorophores. En corrigeant l'image par ce fond, cela pourrait presque être considéré comme bénéque car le voisinage des uorophores se retrouve avec une faible intensité. Cela permet d'isoler les uorophores et diminue le risque de voir deux uorophores voisins être considérés comme une unique particule.

Nous utiliserons les deux dernière estimations du fond. En notant D(x, y) les valeurs brutes des pixels, le fond estimé par moyenne locale sera noté Fml[D(x, y)]et celui obtenu par rolling-

3.2 Détection des particules 59

Figure 3.4  Schéma de principe de la méthode de rolling-ball appliquée à une fonction à une dimension. Un motif (carré rouge) est déplacé le long de la courbe en prenant la valeur la plus élevée possible tout en ne dépassant la courbe par aucun des points du motif. La surface ainsi balayée est considérée comme étant le fond de l'image que l'on pourra retrancher au signal. Dans le cas d'une image, on étend ce principe à deux dimensions.