Serum Plasma Serum Plasma

Healthy Localised breast tumors

Metastatic breast cancer

Figure III. Quantification du taux de nétrine-1 soluble humaine par méthode ELISA à

partir de sérums et plasmas sanguins.

sérums, prélevés chez des patientes saines, atteintes d’un cancer du sein localisé ou d’un cancer du sein métastatique. Cette analyse met en évidence que les plus faibles taux de protéine soluble sont retrouvés chez les femmes ne présentant pas de cancer. A l’inverse, les patientes atteintes d’un cancer localisé présentent en moyenne des taux de nétrine-1 sérique plus élevés que les patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique. (B) Les taux de nétrine-1 sériques et plasmatiques ont été comparés à partir de sang frais prélevé chez deux patientes atteintes d’un cancer métastatique du sein. Cette comparaison met en évidence des taux de nétrine-1 soluble bien plus élevés dans les plasmas que dans les sérums de chacune des deux patientes.

Mean = 4,49 N T -1 ( n g /m L) N T -1 ( n g /m L) N T -1 ( n g /m L) Mean = 24,86 Mean = 12,55

1 sérique des patientes à cancers localisés ce qui est contradictoire avec les données obtenues

par RT-PCR-Quantitative (figure IIIA). Toutefois, les variations observées sont trop

importantes pour valider statistiquement cette observation et l’analyse d’un plus grand nombre d’échantillon est nécessaire pour confimer ou infirmer ce résultat.

De plus, l’analyse du taux de Nétrine-1 sérique et plasmatique sur une même patiente révèle que la méthode ELISA basée sur le dosage sérique est peu sensible en comparaison avec un dosage plasmatique. En effet, le taux de Nétrine-1 détecté dans le plasma est au moins 3 fois supérieur au taux de Nétrine-1 détecté dans le sérum pour une même patiente atteinte d’un cancer du sein métastatique (figure IIIB). Une hypothèse pour expliquer cette différence de détection est une interaction aspécifique de la Nétrine-1 (via son domaine C-terminal connu pour interagir avec des constituants de la matrice extracellulaire et les membranes cellulaires) avec le fibrinogène ou avec les cellules sanguines présents dans le plasma mais absents dans le sérum.

L’ensemble de ces résultats révèle donc un problème de sensibilité des tests sériques jusqu’alors réalisés et nous essayons actuellement de mettre au point un test ELISA basé sur la détection de la Nétrine-1 dans le plasma. Les tests en cours visent à déterminer quel anticoagulant nous pourrions utiliser pour doser la Nétrine-1 plasmatique en interférant le moins possible avec le test ELISA lui-même pour obtenir des résultats non-biaisés. En effet, certains anticoagulants modifient le pH (exemple : le Citrate de sodium) ou la concentration en sel (exemple : EDTA), éléments pouvant entraîner des modifications conformationelles des protéines et donc perturber les dosages utilisant des anticorps dirigés contre des épitopes spécifiques. La Nétrine-1 est également capable de lier les groupements héparane-sulfate et ainsi, l’utilisation de l’héparine comme anticoagulant pourrait aussi pertuber le test.

En conclusion, ces résultats, bien que préliminaires, permettent de compléter notre première étude effectuée sur le rôle de la Nétrine-1 dans les cancers du sein. Ils confirment tout d’abord à partir de l’analyse d’un plus grand nombre de biopsies, la corrélation entre la surexpression de Nétrine-1 et la dissémination métastatique, mais aussi avec d’autres marqueurs d’aggressivité comme le nombre de ganglions envahis, l’invasion des tissus adjacents et également potentiellement avec le marqueur d’aggressivité tumorale HER2. Par ailleurs, l’utilisation de plusieurs modèles proches de la tumorigenèse mammaire humaine a permis de valider in vivo l’effet d’une éventuelle thérapie basée sur l’inhibition de la Nétrine-1 à la fois sur la croissance tumorale et sur la dissémination métastatique. En particulier, nous avons montré sur un modèle utilisant des tumeurs mammaires fraîches humaines

- 75 - surexprimant la Nétrine-1 que le peptide DCC-5Fbn avait une efficacité supérieure à la chimiothérapie de référence sur la régression tumorale et l’échappement métastatique. Enfin, les premiers résultats obtenus sur la quantification du taux de la Nétrine-1 dans le sang a permis de montrer qu’un dosage de Nétrine-1 est réalisable. Toutefois, contrairement à ce qui a été observé à partir de l’analyse des tumeurs primaires, il apparaît en première approche que les taux de Nétrine-1 les plus élevés ne sont pas détectés dans les sérums de patientes avec des cancers métastatiques sans doute à cause d’un problème de détection de la Nétrine-1 dans le sérum. Pour répondre à ces différents points, nous sommes actuellement en train d’élargir le nombre d’échantillon sérique analysé et de mettre au point une méthode de dosage de la Nétrine-1 plasmatique.

Article 3 : Le blocage de la Nétrine-1 induit la mort cellulaire dans les cancers du poumon non-à-petites-cellules

Interference with netrin-1 triggers tumor cell death in Non Small Cell Lung Cancer

Delloye-Bourgeois C., Brambilla E., Coissieux MM., Guenebeaud C., Pédeux R., Brambilla C., Mehlen P., Bernet A., JNCI 2009

Après les travaux réalisés sur le cancer du sein, nous nous sommes intéressés à un autre cancer fréquent : le cancer du poumon non-à-petites-cellules. Pour ces travaux, j’ai participé à la caractérisation du rôle de la Nétrine-1 dans la tumorigenèse pulmonaire in vivo par la réalisation de xénogreffes chez la souris nude.

Nous avons analysé le taux d’expression de Nétrine-1 par RT-PCR-Quantitative dans 92 échantillons tumoraux par rapport aux tissus sains adjacents. Nous avons observé qu’environ 80% des tumeurs présentaient une surexpression de Nétrine-1 sans corrélation significative avec le grade tumoral ou avec le type tumoral analysé (adénocarcinomes ou carcinomes épidermoïdes, ces deux types de cancers du poumon non-à-petites-cellules étant les plus fréquents). Ces résultats ont été confirmés par immunomarquage anti-Nétrine-1 et par des hybridations in situ sur des coupes de tumeurs. De manière intéressante, alors que les immunohistochimies révèlent une présence diffuse de la Nétrine-1 dans le poumon, les hybridations in situ indiquent clairement que l’ensemble des cellules tumorales n’exprime pas la Nétrine-1 mais que seule une sous-population tumorale épithéliale possède cette propriété. Par ailleurs, il a été montré que l’expression des récepteurs UNC5H1-4 était conservée entre tissu sain et tumoral alors que l’expression du récepteur DCC était systématiquement perdue.

Afin d’étudier le rôle de la Nétrine-1 dans la tumorigenèse pulmonaire, nous avons analysé le taux d’expression de la Nétrine-1 dans un panel de 25 lignées tumorales pulmonaires humaines. Nous avons ainsi caractérisé les lignées H358, H322 et A427 comme des lignées exprimant fortement la Nétrine-1 de manière autocrine et la lignée H460 comme une lignée n’exprimant pas la Nétrine-1 (montré par RT-PCR-Quantitative puis confirmé par immunohistochimie). L’expression des récepteurs UNC5H1-4 a également été détectée dans l’ensemble de ces lignées contrairement à l’expression du récepteur DCC dont l’expression est systématiquement perdue.

Nous avons montré que la Nétrine-1 produite de manière autocrine par les lignées pulmonaires tumorales Nétrine-1 positive était un facteur de survie pour ces cellules in vitro et nous avons également montré que les mécanismes pro-apoptotiques induits par la privation de Nétrine-1 impliquaient les récepteurs UNC5H et la DAPk. L’inhibition de la Nétrine-1 par

- 77 - siRNA ou par le peptide DCC-5Fbn induit la mort des cellules Nétrine-1 positives H358, H322 et A4127 par apoptose in vitro alors qu’aucun effet de ces agents anti-Nétrine-1 n’est constaté sur la lignée H460. Par ailleurs, nous avons montré dans la lignée H358 que l’apoptose induite par l’inhibition de la Nétrine-1 était principalement liée à l’activation des voies de signalisation apoptotiques des récepteurs UNC5H1 et UNC5H2 car la co-transfection de siRNA ciblant ces deux récepteurs inhibe la mort cellulaire induite par le siRNA Nétrine-1 (lignée H358) au contraire des siRNA dirigés contre les récepteurs UNC5H3, UNC5H4 et DCC. De plus, il a été montré que cette apoptose était liée à l’activation de la DAPk via sa déphosphorylation en absence de Nétrine-1.

D’autre part, la fonction de facteur de survie de la Nétrine-1 pour les cellules tumorales pulmonaires a été confirmée in vivo à l’aide d’un modèle de xénogreffe réalisé chez la souris nude. Nous avons réalisé deux séries de xénogreffes des lignées H358 (Nétrine-1 positive) et H460 (Nétrine-(Nétrine-1 négative) chez la souris nude où nous avons comparé l’effet du peptide inhibiteur de la Nétrine-1 (DCC-5Fbn) avec du PBS ou bien l’effet du siRNA Nétrine-1 avec du siRNA Scramble. Nous avons observé que le peptide DCC-5Fbn tout comme le siRNA Nétrine-1 induisent une régression des tumeurs H358 (Nétrine-1 +++) et que cette régression est liée à l’apoptose des cellules tumorales (augmentation du marquage TUNEL sur des coupes de tumeurs H358 traitées ou contrôles). Au contraire, ni le siRNA Nétrine-1, ni le peptide DCC-5Fbn n’ont d’effet sur la croissance des tumeurs H460 (Nétrine-1 négative) et sur leur mortalité in vivo.

En conclusion, nous avons montré que la Nétrine-1 est surexprimée dans la plupart des cancers pulmonaires non-à-petites-cellules où elle joue le rôle de facteur de survie. Toutefois son taux d’expression n’a pu être corrélé avec l’aggressivité tumorale par l’analyse du grade et du type cellulaire tumoral. De manière intéressante, les hybridations in situ et les immunomarquages réalisés sur des coupes tumorales révèlent que la Nétrine-1 est transcrite dans les cellules épithéliales tumorales. Ces données suggèrent que les cellules tumorales produisent la Nétrine-1 de façon autocrine. Par ailleurs, les cancers du poumon se subdivisent en deux grandes catégories : les cancers du poumon à petites cellules qui sont traités par chimiothérapie et les cancers du poumon non-à petites-cellules qui sont généralement traités par chirurgie car ils répondent mal aux chimiothérapies. Ainsi, la caractérisation du rôle de facteur de survie de la Nétrine-1 pour les cellules tumorales de cancers pulmonaires non-à petites-cellules suggère que l’inhibition de la Nétrine-1 dans ces cancers pourrait être une nouvelle alternative thérapeutique.

Netrin-1, a diffusible laminin-related protein, has a major role in the control of neuronal navigation during development of the nervous system through interaction with its main receptors, deleted in colorectal cancer (DCC) ( 1 – 3 ) and uncoordinated-5-homolog (UNC5H), a group of the four UNC5H1, UNC5H2,

UNC5H3, and UNC5H4 receptors ( 4 , 5 ). Recently, netrin-1,

along with other neuronal guidance proteins like semaphorins, has also been shown to contribute to the patterning of developing epithelial tissues such as mammary gland, pancreas, and lung by regulating diverse processes including adhesion, motility, prolif-eration, and differentiation of cells in many non-neuronal tissues ( 6 , 7 ). Netrin-1 also regulates cell survival, and DCC and UNC5H receptors belong to the so-called dependence receptor family, whose members has a critical role in inducing cell death ( 8 – 10 ).

The dependence receptors induce cell death only when disen-gaged from their ligand(s), and this creates cellular states of depen-dence on the ligands ( 11 , 12 ). The molecular mechanisms used by these unbound receptors to trigger apoptosis are largely unknown. A common mechanistic feature appears to be cleavage of the receptors

by caspases; this cleavage is required for cell death induction because it allows the exposure and/or release of a proapoptotic domain, which induces apoptosis ( 8 , 13 ), probably by interacting with

proapop-totic proteins such as neurotrophin receptor – interacting MAGE

homolog or the serine/threonine kinase, death-associated protein kinase (DAP-kinase) ( 14 , 15 ).

Affiliations of authors: Apoptosis, Cancer and Development Laboratory — Equipe labellisée ‘La Ligue ’ , CNRS UMR5238, Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon, France (CD-B, M-MC, CG, PM, AB); Lung Cancer Team, Institut Albert Bonniot, Inserm U823, Université Joseph Fourier, Pathology Department, Centre Hospitalier Universitaire, Grenoble, France (EB, RP, CB); CNRS FRE2944 Epigénétique et cancer, Institut André Lwoff, Villejuif, France (VF, FC) . Correspondence to: Patrick Mehlen, PhD, Apoptosis, Cancer and Development Laboratory — Equipe labellisée ‘La Ligue ’ , CNRS UMR5238, Université de Lyon, Centre Léon Bérard, 69008 Lyon, France (e-mail: mehlen@lyon.fnclcc.fr ). See “Funding” and “Notes” following “References.”

DOI: 10.1093/jnci/djn491

© The Author 2009. Published by Oxford University Press. All rights reserved.

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Interference With Netrin-1 and Tumor Cell Death in