En parallèle des études sur la tumorigenèse et sur le développement d’une thérapie ciblée contre les cancers surexprimant la Nétrine-1, je me suis intéressée à la signalisation apoptotique des récepteurs UNC5H. J’ai ainsi d’une part participé à la caractérisation du rôle de l’oligomérisation des récepteurs UNC5H et DCC dans la régulation de leur signalisation et d’autre part à l’identification de nouveaux effecteurs pro-apoptotiques de la signalisation des récepteurs UNC5H.
Article 4 : Mécanisme d’induction de la mort des cellules tumorales Nétrine-1 dépendante par le peptide DCC-5Fbn.
Interfering with multimerization of netrin-1 receptors triggers tumor cell death
Mille F., Llambi F., Guix C., Delloye-Bourgeois C., Guenebeaud C., Castro-Obregon S., Bredesen DE., Thibert C., Mehlen P., Cell Death & Differentiation 2009
Pour induire la mort cellulaire, les récepteurs de mort s’oligomérisent en présence de leur ligand via leur domaine de mort. D’autre part, leur activité pro-apoptotique peut être inhibée par des récepteurs leurres (Decoy Receptor) capables de titrer leur ligand (en particulier TRAIL).
Nous avons voulu savoir si les récepteurs à dépendance UNC5H et DCC suivaient le même schéma en présence de Nétrine-1 et si le peptide DCC-5Fbn était capable de titrer la Nétrine-1 à la manière des récepteurs leurres ou bien s’il interférait différemment avec la signalisation positive médiée par la Nétrine-1 via ses récepteurs à dépendance.
Les premières expériences réalisées ont été des expériences de
co-immunoprécipitation sur des cellules HEK293T exprimant des constructions UNC5H2 ou DCC fusionnées avec des séquences tags protéiques différentes. Il a ainsi été montré que les récepteurs UNC5H2 et DCC étaient capables d’homodimérisation, phénomène renforcé par l’ajout dans le milieu de culture ou la transfection de Nétrine-1.
Afin d’étudier le rôle fonctionnel de cette dimérisation sur la signalisation induite par les récepteurs DCC et UNC5H2 nous avons mis en place un système de dimérisation artificiel. Des constructions des récepteurs UNC5H2 et DCC fusionnés avec le domaine de dimérisation artificiel Fv2e ont été réalisées, ces protéines fusions étant capables de se
- 79 - dimériser en présence de la molécule de synthèse AP20 formant un pontage chimique entre les domaines Fv2e. Nous avons co-transfecté dans des cellules HEK293T, traitées ou non avec la drogue AP-20, les constructions Fv2e-UNC5H2-HA et Fv2e-UNC5H2-Myc ou les constructions Fv2e-DCC-HA et Fv2e-DCC-Myc. Nous avons contrôlé par co-immunoprécipitation que la drogue AP-20 induisait bien une homodimérisation respective des récepteurs UNC5H2 et DCC et nous avons montré qu’elle était associée à la perte de la fonction apoptotique des récepteurs UNC5H2 et DCC.
Dans un deuxième temps, nous avons cherché à caractériser le mode d’action du peptide DCC-5Fbn ce dernier pouvant hypothétiquement restaurer l’apoptose des cellules tumorales surexprimant la Nétrine-1 via deux mécanismes : (i) l’inhibition de la fixation de la Nétrine-1 sur ses récepteurs UNC5H (le récepteur DCC n’étant pas exprimé dans les tumeurs et lignées tumorales analysées) ou bien (ii) l’inhibition du processus d’oligomérisation induit par la Nétrine-1.
Afin de savoir si le peptide DCC-5Fn était capable de lier la Nétrine-1 et de l’empêcher de se fixer sur ses récepteurs, nous avons dans un premier temps réalisé deux types de tests ELISA visant d’une part à vérifier que le peptide DCC-5Fbn interagissait directement avec la Nétrine-1 et d’autre part à voir si cette interaction était suffisante pour inhiber la fixation de la Nétrine-1 sur son récepteur DCC. Pour caractériser l’interaction entre la Nétrine-1 et le peptide, nous avons adsorbé dans les puits de plaque ELISA le peptide DCC-5Fbn (dose fixe) et nous avons ajouté de la Nétrine-1 recombinante à dose croissance. Après lavage, nous avons dosé la Nétrine-1 résiduelle présente dans chaque puits à l’aide d’un anticorps spécfique et nous avons réalisé la courbe de dissociation Nétrine-1/DCC-5Fbn qui nous a permis d’estimer la constante de dissociation de ce complexe à 5nM traduisant d’une forte affinité du DCC-5Fbn pour la Nétrine-1 (à titre comparatif, le Kd du couple Fas/FasL a été estimé à 7.4nM soit un ordre de grandeur similaire (Connolly et al., 2001)).
Le deuxième type de test ELISA que nous avons réalisé correspond à des ELISA de type « sandwich » visant à déterminer l’impact du peptide DCC-5Fbn sur une interaction pré-existante entre la Nétrine-1 et son récepteur DCC. Pour cela, nous avons adsorbé le domaine extracellulaire du récepteur DCC (DCC-EC-Fc) au fond des puits et nous avons pré-incubé de la Nétrine-1 dans ces puits (figure IV). Dans un deuxième temps, nous avons ajouté le peptide DCC-5Fbn soluble à des doses croissantes (figure IV) et après lavage nous avons dosé la quantité de Nétrine-1 résiduelle présente dans les puits. Nous n’avons pas observé de réduction du taux de Nétrine-1 fixée quelque soit la dose de peptide DCC-5Fbn ajoutée.
Figure IV. Schéma des ELISA sandwich comparant l’affinité du domaine extracellulaire
de DCC et du peptide DCC-5Fbn avec la Nétrine-1.
Cette expérience consiste à adsorber au fond des puits le peptide DCC-Fc (étape 1) correspondant au domaine extracellulaire du récepteur DCC.
Etape 1 Etape 2 Etape 3
Dos e 3 Dose 2 D os e 1 Etape 4 Nétrine-1 DCC-5Fbn Dosage de la Nétrine-1 résiduelle contrôle Anticorps anti-Nétrine-1
- 80 - Ainsi, bien que le peptide DCC-5Fbn soit capable de lier la Nétrine-1, il n’est pas capable de perturber l’interaction pré-existante entre la Nétrine-1 et le récepteur DCC.
Nous avons donc cherché à savoir si l’induction de la mort cellulaire induite par le DCC-5Fbn sur des cellules Nétrine-1 dépendante était due à une inhibition de l’oligomérisation des récepteurs DCC ou UNC5H2. Pour cela, nous avons réalisé des expériences de co-immunoprécipitation qui nous ont permis de montrer que l’oligomérisation des récepteurs DCC observée en présence de Nétrine-1 était inhibée par le peptide DCC-5Fbn sur des cellules HEK293T.
En conclusion, nous avons montré que l’oligomérisation des récepteurs UNC5H2 et DCC observée en présence de Nétrine-1 était suffisante pour inhiber leur fonction pro-apoptotique in vitro. En outre, l’analyse de l’interaction du peptide DCC-5Fbn avec la Nétrine-1 ou avec le complexe Nétrine-1/DCC a permis de mettre en évidence le mécanisme d’action potentiel du peptide DCC-5Fbn pour induire la mort des cellules Nétrine-1 dépendante. En effet, il semble que le peptide soit capable d’induire la mort cellulaire non pas en titrant la Nétrine-1 et en inhibant sa fixation sur son récepteur DCC mais en inhibant l’oligomérisation du récepteur DCC indispensable à la survie cellulaire. Toutefois, dans les tumeurs mammaires et pulmonaires, il a été montré que l’expression du récepteur DCC est perdue et que la fonction de facteur de survie de la Nétrine-1 sur des lignées tumorales dérivées de ces deux tissus était médié par les récepteurs UNC5H. Ainsi, le mode d’induction de l’apoptose du peptide DCC-5Fbn sur les cellules tumorales exprimant fortement comme facteur de survie la Nétrine-1 reste à élucider. Néanmoins, cette étude révèle également de manière intéressante que le processus d’oligomérisation du récepteur UNC5H2 en présence de Nétrine-1 est un évènement suffisant pour inhiber l’apoptose induite par le récepteur UNC5H2, ce processus constituant ainsi une cible thérapeutique potentielle pour le développement de thérapie contre les cancers à surexpression de Nétrine-1.