Après une présentation des travaux visant à caractériser le rôle de la Nétrine-1 dans la tumorigenèse mammaire et pulmonaire, j’exposerai comment la Nétrine-1 pourrait être ciblée afin de développer une nouvelle thérapie. L’ensemble des travaux sera exposé sous une forme résumée avec les publications ou les résultats correspondants joints.
Article 1 : L’expression de la Nétrine-1 est un avantage sélectif pour la survie des cellules tumorales dans les cancers du sein métastatiques
Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer.
Fitamant J., Guenebeaud C., Coissieux MM., Guix C., Treilleux I., Scoazec JY., Bachelot T., Bernet A., Mehlen P. PNAS, 2008
Afin d’évaluer le rôle de la Nétrine-1 et de ses récepteurs dans la tumorigenèse mammaire, nous avons dans un premier temps analysé le taux d’expression de la Nétrine-1 par RT-PCR-Quantitative à partir d’un panel de 51 échantillons de tumeurs mammaires. Ces biospies tumorales étudiées regroupent 3 types de tumeurs : des tumeurs localisées non-métastatiques (N0, n=16), des tumeurs associées à un envahissement ganglionnaire (N+M0, n=19) et enfin des tumeurs métastatiques d’emblée (M+, n=16), c'est-à-dire prélevées chez des patientes présentant des foyers métastatiques dans divers organes dès le diagnostique de la tumeur primaire. Une surexpression de Nétrine-1 proportionnelle à l’aggressivité tumorale a ainsi pu être mise en évidence. En effet, 31.5% des tumeurs N+M0 présentent une expression de nétrine-1 5 fois supérieures à celle observée pour les tumeurs N0, cette proportion atteignant 62.5% pour les tumeurs métastatiques M+. Parmi ces dernières, 37.5% présentent une surexpression de Nétrine-1 de plus de 15 fois supérieure à la population N0, une telle surexpression n’ayant été retrouvée pour aucune tumeur des deux groupes N0 et N+M0. Par ailleurs, des immunohistochimies réalisées sur des coupes de tumeurs primaires ont confirmé que la Nétrine-1 était largement surexprimée dans les tumeurs M+ par rapport
- 69 - aux tumeurs N+M0. En revanche, aucune différence significative n’a été détectée dans l’expression des récepteurs UNC5H1-3 dans les échantillons tumoraux par rapport aux échantillons de tissus sains associés. L’expression du récepteur DCC est quant à elle perdue dans les trois populations tumorales analysées.
Afin d’étudier le rôle de cette surexpression de Nétrine-1 dans l’échappement métastatique, nous avons utilisé un modèle murin de tumorigenèse mammaire comportant deux lignées tumorales 67NR et 4T1 dérivées d’une même tumeur mammaire de souris Balb/C. Malgré leur origine et leur capacité commune à former des tumeurs primaires mammaires chez la souris Balb/C, seule la lignée 4T1 est capable d’accomplir toutes les étapes du processus métastatique, et de disséminer dans les mêmes organes que ceux affectés en cas de cancer du sein chez la femme : l’os, le poumon, le foie et le cerveau. De manière intéressante, nous avons retrouvé dans ce modèle la différence d’expression observée chez l’homme : la lignée métastatique 4T1 exprime la Nétrine-1 au contraire de la lignée 67NR, expression associée à une production autocrine de la protéine. Par ailleurs, nous avons montré que la Nétrine-1 produite de manière autocrine était un facteur de survie pour les cellules 4T1 in vitro car son inhibition par siRNA ou par un peptide titrant la Nétrine-1 induit l’apoptose de ces cellules en culture, cet agent titrant correspondant à l’un des sites de fixation de la Nétrine-1 sur le récepteur DCC (5ème domaine fibronectine de DCC d’où son nom : DCC-5Fbn). De plus, nous avons montré que l’apoptose des cellules 4T1 induite par la privation de la Nétrine-1 était liée à l’activation des voies de signalisation pro-apoptotiques par les récepteurs UNC5H. En effet, la transfection du mutant dominant négatif UNC5H2-IC-D412N (inhibiteur de la signalisation apoptotique de l’ensemble des récepteurs UNC5H), bloque l’apoptose des cellules 4T1 induite par la privation de Nétrine-1.
En parallèle, nous avons également analysé l’expression de la Nétrine-1 et son rôle de facteur de survie dans les lignées tumorales mammaires humaines. Pour cela, nous avons analysé l’expression de la Nétrine-1 (par RT-PCR quantitative) dans 48 lignées tumorales humaines et nous avons sélectionné les lignées SKBR7 et T47D comme des lignées exprimant fortement la Nétrine-1 au contraire de la lignée MDA-MB231. Nous avons montré que l’inhibition de la Nétrine-1 (par siRNA ou par le peptide bloquant DCC-5Fbn) induisait spécifiquement l’apoptose des cellules exprimant la Nétrine-1 suggérant que le rôle de facteur de survie de la Nétrine-1 est conservé chez l’homme tout comme la production autocrine de Nétrine-1 par les cellules tumorales.
Nous avons ensuite voulu vérifier que la production autocrine de la Nétrine-1 constituait bien un avantage sélectif de survie favorisant la prolifération des cellules
tumorales in vivo et leur dissémination métastatique. Pour cela, nous avons réalisé des clones stables de la lignée 4T1 exprimant le gène de la luciférase firefly permettant le suivi visuel et quantitatif de la progression tumorale in vivo par un processus non-invasif utilisant la bioluminescence. Nous avons injecté les cellules 4T1 par voie intraveineuse à des souris Balb/C, condition selon laquelle les cellules 4T1 colonisent rapidement les poumons et forment des métastases en deux semaines. Ce modèle a permis de démontrer l’efficacité du peptide DCC-5Fbn ou bien du siRNA anti-Nétrine-1 sur la dissémination métastatique des cellules 4T1 et sur la régression des foyers métastatiques formés par les cellules 4T1. En effet, il a été montré que l’administration quotidienne du peptide DCC-5Fbn par voie intrapéritonéale inhibait de manière dose dépendante la formation de foyers tumoraux secondaires en comparaison avec l’injection d’un peptide contrôle FADD (produit dans les mêmes conditions que le peptide DCC-5Fbn), des résultats similaires ayant été obtenus avec l’injection du siRNA Nétrine-1 en comparaison avec un siRNA contrôle. D’autre part, il a été montré que l’inhibition de la Nétrine-1 par le peptide DCC-5Fbn était non seulement capable d’éviter la formation de métastases mais également d’induire une régression des foyers secondaires déjà en place. Pour cette deuxième étude, le début du traitement des souris a été différé au moment où des foyers micrométastatiques pulmonaires sont détectables chez les souris.
En conclusion, cette étude montre que la surexpression de la Nétrine-1 peut être considérée comme un marqueur de la dissémination métastatique chez les patientes atteintes d’un cancer du sein, que cette expression semble correspondre à un avantage sélectif acquis par les cellules tumorales pour s’affranchir de la dépendance induite par l’expression de leurs récepteurs UNC5H (seuls récepteurs à dépendance à Nétrine-1 exprimés dans l’ensemble des cellules utilisées) et que cette caractéristique permet d’envisager une nouvelle approche thérapeutique ciblée basée sur l’inhibition de la Nétrine-1 afin de rétablir l’activité pro-apoptotique de ses récepteurs et d’induire la mort des cellules tumorales, cette approche ayant été validée chez un modèle syngénique murin de cancer du sein.