Figure 14 : Structure de la Nétrine-1 et de ses récepteurs

?

?

Domaine laminine de type IV

Module homologue à l’Epidermal Growth Factor riche en cystéine

Domaine C-terminal

A

β ^{Domaine d’origine du}

peptide Aβ

UPA Domaine UPA Sites de fixation de la Nétrine-1

Via son domaine IV

Via son domaine C

Via un domaine inconnu

?

Figure 14 : Structure de la Nétrine-1 et de ses récepteurs

La Nétrine-1 est une protéine appartenant à la famille des laminines capable de fixer le domaine extracellulaire de plusieurs récepteurs via son domaine C-terminal ou son domaine apparenté aux laminines de type IV. Ces 8 récepteurs ont un domaine de fixation à la Nétrine-1 variable : domaine fibronectine 4-5 pour DCC, domaines Ig pour UNC5H, extrémité N-terminale du domaine Aβ (APP) et domaines Ig 7-9 (DSCAM). Les domaines de fixation de Néogénine, des intégrines α3β1 et α6β4 et de A2b indiqués sont hypothétiques.

Nétrine-1 Récepteurs à dépendance à Nétrine-1 Domaine MIDAS Domaine Fibronectine Domaine immunoglobuline

Le domaine C est le domaine le moins conservé entre les espèces et ne semble pas nécessaire à la fonction propre des Nétrines. Parmi les Nétrines, la Nétrine-1 correspond au ligand des récepteurs à dépendance UNC5H et DCC (appelés récepteurs à dépendance à Nétrine-1 par la suite). La Nétrine-1 est également capable de se lier à d’autres récepteurs sans pour autant induire un état de dépendance vital des cellules. Nous appelerons donc plus simplement ces autres récepteurs : récepteurs à la Nétrine-1. La Nétrine-1 est capable d’interagir avec ses récepteurs via deux domaines : son domaine C et son domaine VI. Alors que son domaine C est riche en acides aminés basiques et capable de lier l’héparine, les héparanes sulfates et les glycolipides, permettant aux Nétrines de fixer différents composants de la matrice extracellulaire de manière aspécifique tels que les intégrines (Keino-Masu et al., 1996; Serafini et al., 1994; Yebra et al., 2003), le domaine VI de la Nétrine-1 de part sa structure globulaire reconnaît spécifiquement des domaines extracellulaires des récepteurs

UNC5H, et DCC (figure 14).

2. Les récepteurs à dépendance à Nétrine-1

Bien qu’ayant un ligand commun, les récepteurs DCC et UNC5H ont une structure très différente (figure 14). La Nétrine-1 est capable de lier la partie extracellulaire de ces deux récepteurs respectivement au niveau de leurs domaines fibronectines 4 et 5, et de leurs deux domaines immunoglobulines (figure 14)(Bennett et al., 1997; Geisbrecht et al., 2003; Kruger et al., 2004). En particulier, dans le cas du récepteur DCC, il est à noter qu’il existe une controverse concernant son domaine d’interaction avec la Nétrine-1. En effet, alors que les groupes Leahy et Linsley ont montré notamment par des expériences de pull-down que la

Nétrine-1 interagissait avec le 5^ème domaine fibronectine du récepteur DCC, le groupe Guan a

montré par des expériences de co-immunoprécipitations que la Nétrine-1 était capable

d’interagir avec le 4^ème domaine fibronectine de DCC. Au laboratoire, nous avons réconcilié

ces deux études puisque nous avons montré en test ELISA que deux peptides recombinants

correspondants respectivement au 4^ème domaine fibronectine (DCC-4Fbn) et au 5^ème domaine

fibronectine (DCC-5Fbn) de DCC étaient tous deux capables d’interagir avec la Nétrine-1. De plus, par des expériences d’immunofluorescence, nous avons mis en évidence que ces deux peptides sont capables de se fixer aux membranes cellulaires où ils colocalisent avec la Nétrine-1 endogène produite par des cellules (lignées tumorales à expression autocrine de Nétrine-1), et l’ajout de Nétrine-1 exogène inhibe cette colocalisation (donnée non-publiée). D’un point de vue plus fonctionnel il a également été montré que ces deux peptides (DCC-4Fbn et DCC-5Fbn) étaient capables d’induire la mort cellulaire de cellules Nétrine-1

- 41 - dépendantes exprimant les récepteurs UNC5H ou DCC suggérant que ces deux peptides sont capables de titrer la Nétrine-1 et/ou d’inhiber sa fonction anti-apoptotique médiée à la fois par les récepteurs à dépendance UNC5H et DCC. Ainsi, l’ensemble de ces données suggère que la Nétrine-1 est capable d’interagir à la fois avec les domaines fibronectines 4 et 5 du récepteur à dépendance DCC, et que cette interaction est nécessaire à la fonction anti-apoptotique de la Nétrine-1.

Alors que le domaine intracellulaire du récepteur DCC ne contient pas de domaine particulier impliqué dans les processus apoptotiques, le domaine intracellulaire des récepteurs UNC5H comporte : un domaine de mort (DD) et un domaine ZU-5 (Zona Occludens/Unc5 homology domain) indispensables à sa fonction pro-apoptotique (figure 14). En effet, la délétion de ces deux domaines sur les récepteurs UNC5H est associée à une perte de leur pouvoir pro-apoptotique lorsqu’ils sont surexprimés dans des cellules en culture (Llambi et al., 2001; Williams et al., 2003a). Outre ces deux domaines, les récepteurs UNC5H sont également constitués d’un domaine de liaison à DCC (DB pour DCC Binding) également appelé UPA car conservé entre les protéines UNC5H, PIDD et les Ankyrines. Ce dernier domaine n’est pas indispensable au pouvoir pro-apoptotique des récepteurs UNC5H car les protéines UNC5H2-WT et UNC5H2∆UPA induisent la mort cellulaire de manière similaire sur des cellules en culture. Toutefois, il semble que la conformation du domaine UPA soit capable de stimuler ou bien d’inhiber le pouvoir pro-apoptotique du récepteur UNC5H2 en modulant la conformation entière du domaine intracellulaire (cf figure 13)(Wang et al., 2009a).

3. Les autres récepteurs à la Nétrine-1

La Nétrine-1 est également capable de se fixer sur d’autres récepteurs transmembranaires tels que Néogénine, les intégrines α₃β₁ et α₆β₄, APP, DSCAM (Down Syndrome Cell Adhesion Molecule) ou encore A2b (Corset et al., 2000; Liu et al., 2009; Lourenco et al., 2009; Ly et al., 2008; Srinivasan et al., 2003; Yebra et al., 2003). Bien que le domaine d’interaction de Néogénine, d’A2b et des intégrines avec la Nétrine-1 n’ait pour l’instant pas été identifié, la forte homologie structurale de Néogénine et DCC ainsi que la structure du domaine extracellulaire des intégrines α3β1 et α6β4 suggère que ceux sont leurs domaines fibronectines 4-5 et leurs domaines MIDAS respectifs qui sont responsables de la

liaison de la Nétrine-1 (figure 14). Le récepteur APP lie la Nétrine-1 au niveau de la partie

N-terminale du domaine Aβ et le récepteur DSCAM au niveau de ses domaines

Ces récepteurs n’ont pas été caractérisés comme des récepteurs à dépendance à Nétrine-1 mais modulent l’action de la Nétrine-1 dans divers processus physiologiques tels que la survie cellulaire, le guidage axonal et la morphogenèse de certains organes que je détaillerai dans la partie IV de ce chapitre.

B. Signalisation positive des récepteurs DCC et UNC5H en présence de

Nétrine-1

En présence de Nétrine, les récepteurs UNC5H et DCC activent trois types de voies de signalisation faisant intervenir (i) de nombreuses protéines kinases, (ii) certaines RhoGTPases ou (iii) permettant de moduler la concentration cytosolique de calcium. Ces voies stimuleraient ainsi la prolifération et la survie cellulaire et permettraient également de remodeler le cytosquelette, élément essentiel à l’une des fonctions majeures des récepteurs UNC5H et DCC : le guidage axonal consistant en la projection et à l’orientation d’axones à partir de corps cellulaires neuronaux (voir paragraphe IV page 48)(Mehlen and Furne, 2005).

1. Voie des protéines kinases

En présence de Nétrine-1, les récepteurs UNC5H et DCC sont présents dans les membranes des cellules à l’état d’oligomères, localisés dans les rafts dans le cas du récepteur DCC. Sous cette forme, les récepteurs UNC5H et DCC sont phosphorylés via l’intervention des protéines kinases FAK, Fyn et la famille Src (Li et al., 2006b; Ren et al., 2008). Sous leur forme phosphorylés, les récepteurs DCC et UNC5H vont activer des protéines kinases effectrices : PI(3)K, Akt et ERK1/2 (Forcet et al., 2002; Nguyen and Cai, 2006; Tang et al., 2008). Il est à noter que dans le cas du récepteur UNC5H2 l’activation de cette deuxième série de protéine kinase se fait via l’intervention de la protéine adaptatrice à activité GTPase PIKE-L interagissant avec le domaine intracellulaire du récepteur UNC5H et son domaine de mort (figure 15)(Tang et al., 2008).

Les kinases effectrices stimulent la prolifération et la survie cellulaire via les mécanismes évoqués précédemment (voir chapitre 1, IV.D p20) mais aussi par des mécanismes indépendants. En effet, il a été montré que la Nétrine-1 était capable d’induire spécifiquement via la voie ERK1/2, l’activation du facteur de transcription Elk1 (Forcet et al., 2002). Dans les mêmes conditions, DCC est capable via la voie ERK d’induire l’activation du facteur de transcription NFAT (figure 15)(Graef et al., 2003). Les cibles de ces deux régulateurs transcriptionnels sont nombreuses et comprennent : des facteurs impliqués dans la migration et la prolifération cellulaire tels que cyclooxygénase 2 (COX2) et l’autotaxine qui

UNC5B DCC

Figure 15: Signalisation positive des récepteurs DCC et UNC5H en présence de Nétrine : voie