(a) Mise au point des conditions réactionnelles
A l’issue de nos travaux portant sur la synthèse des plateformes β-peptidiques, nous sommes en possession d’un certain nombre d’oligomères provenant de différentes sources. Nous avons des composés issus de la série Boc/OMe obtenus par application de la voie alternative décrite précédemment ainsi que les oligomères de la série Fmoc/OtBu (Figure 53).
117 Figure 53 – Plateformes β-peptidiques de la série « propargylamide »
Ceci nous a permis d’accéder à un certain nombre de composés glycoconjugués en mettant en œuvre des réactions de CuAAC où les plateformes présentent ici le partenaire alcyne « -C
≡
CH ».Schéma 57 - Réaction de CuAAC
La mise au point des conditions réactionnelles dans cette série a débuté sur le monomère 53, en utilisant comme partenaire « azoture » les dérivés du D-galactose 134 et 135 qui ont été synthétisés au laboratoire à partir de protocoles décrits.177,178 Les meilleures conditions ont ensuite été étendues au dimère 60.
Oligomère Sucre CuSO4.H2O (0,1M aq.) Acide ascorbique (0,1M aq.) Solvant Composé glycoconjugué Rdt a Monomère 53 134 0,08 éq. 0,24 éq. tBuOH/ H2O 1:1 136 53% Monomère 53 135 0,08 éq. 0,24 éq. DMF 137 88% Dimère 60 135 0,16 éq. 0,48 éq. DMF 138 65% a
: rendement après purification
118 Le monomère 53 est traité par 1,0 équivalent de sucre 134 dans un mélange tBuOH/H2O 1:1 dans les conditions de CuAAC décrites dans le Tableau 7. Le composé glycoconjugué 136 est obtenu avec un rendement de 53% et une excellente pureté (HPLC > 99%).
Sachant que les oligomères plus longs de cette série ne sont plus solubles dans le mélange tBuOH/H2O 1:1, nous avons testé la réaction de CuAAC dans le DMF.179,173 Nous avons testé la réaction dans le DMF avec le 6-azido-D-galactopyranoside 135. Dans les conditions décrites précédemment, le composé 137 est obtenu avec un rendement de 88% et une très bonne pureté (HPLC = 94%).
Nous avons ensuite testé les conditions de réaction sur le dimère 60 avec le même sucre modèle 135. Après 20h de réaction, le suivi de la réaction montrait toujours des traces de matériel de départ. Les quantités de cuivre et d’acide ascorbique ont donc été doublées pour atteindre respectivement 0,16 et 0,48 équivalents. Après purification par chromatographie sur gel de silice, le dimère glycoconjugué 138 est obtenu avec un rendement de 65% et une excellente pureté (HPLC > 99%).
Il est à noter que le composé 138 ne présente pas de problème de solubilité contrairement au dimère non conjugué 60. L’introduction des unités saccharidiques devrait donc améliorer nettement la solubilité des composés.
(b)Synthèse des composés glycoconjugués
Ayant mis au point les conditions de CuAAC les plus adaptées à nos composés, nous les avons appliquées à la synthèse des glycoconjugués d’oligomères issus de la série Boc/OMe et Fmoc/OtBu.
Série Boc/OMe
Dans cette série, nous disposons des monomère, dimère et trimère, ce dernier ne présentant une pureté moyenne en raison des problèmes de purification liés à son manque de solubilité. Les problèmes de purifications ont été résolus ultérieurement en série Fmoc/OtBu.
Nous avons donc appliqué les conditions de CuAAC précédemment décrites sur le dimère et le trimère avec le résidu GalNAc 116.
119 Schéma 58 – Greffage des unités saccharidiques sur le dimère 60 et le trimère 62
Le composé 139 a été obtenu avec un rendement de 78% après purification. Dans le cas du trimère 140, la réaction a été effectuée sur une très petite quantité, ce qui ne nous pas permis de le purifier. Mais sa formation a été attestée lors du suivi de la réaction par CCM qui montrait la présence d’un unique produit et le pic moléculaire a bien été observé par HR-MS.
Série Fmoc/OtBu
Cette série est complète : nous disposons des oligomères « propargylamide », du monomère jusqu’à l’hexamère. Nous avons donc appliqué les conditions de CuAAC précédemment décrites sur chacun d’entre eux avec le dérivé du D-mannose 114 comme partenaire « azoture ».
Il est apparu que les conditions précédemment utilisées et appliquées ici au monomère 67, à savoir 0,16 équivalent de CuSO4 et 0,48 équivalent d’acide ascorbique, n’ont pas permis une conversion totale de ce dernier. En effet, après 24h de réaction, on observe bien la formation d’un unique composé mais il reste une grande quantité de monomère 67.
120 Les quantités de cuivre et d’acide ascorbique ont donc été progressivement augmentées par tranches respectives de 0,08 équivalent et 0,24 équivalent Finalement, en utilisant 1,0 équivalent de cuivre et 3,0 équivalents d’acide ascorbique, on obtient le monomère glycoconjugué 141 avec un rendement de 82% et une excellente pureté (HPLC = 96%). La modification des groupements protecteurs a manifestement eu un effet significatif sur les conditions de cette réaction. Dans cette topologie, le monomère 67 doit être un bon ligand du cuivre, ce qui explique sans doute qu’on ait été obligé d’augmenter les quantités de cuivre dans de telles proportions. Ce comportement a été observé pour le reste de la série jusqu’au tétramère. Les glycoconjugués sont tous obtenus en utilisant 1,0 équivalent de cuivre et 3,0 équivalents d’acide ascorbique dans le DMF. Le nombre d’équivalents de cuivre est rapporté à la quantité d’oligomère de départ. Ainsi, on constate que la quantité de cuivre nécessaire par résidu diminue avec l’allongement de la chaîne. Par exemple, pour le tétramère 144, 1 équivalent de cuivre correspond à 0,25 équivalent par résidu. Ceci met en évidence le caractère auto-catalytique de la réaction. Les puretés des composés obtenus après chromatographie flash sont très satisfaisantes (HPLC > 96%).
Schéma 60 – Synthèse des édifices glycoconjugués 142, 143, 144 et 145
A ce jour, nous n’avons pas réussi à obtenir l’hexamère glycoconjugué 145. En effet, l’hexamère 76 présente une telle insolubilité dans le DMF qu’il est impossible de suivre l’évolution de la réaction que ce soit par CCM ou par HPLC.
Dans le cadre du projet « Immunothérapie anticancéreuse », nous avons synthétisé le trimère glycoconjugué 146 qui sera par la suite utilisé pour un test de reconnaissance antigène-anticorps. Il est obtenu avec un rendement de 73% et une pureté HPLC de 85%.
121 Schéma 61 – Synthèse du glycoconjugué 146
(c) Optimisation des conditions de réaction
Les réactions de CuAAc menées sur les oligomères de la série « propargylamide » Fmoc/OtBu ne peuvent plus être considérées comme catalysées au cuivre puisqu’il a été nécessaire d’en utiliser 1,0 équivalent. Nous avons donc décidé d’effectuer une courte étude méthodologique afin d’optimiser ces conditions de réaction. Nous avons testé différentes sources de cuivre et différentes conditions réactionnelles, résumées dans le Tableau 8.
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Essai Oligomère Source de
Cu(I) Additif Solvant Conditions
Composé glycoconjugué Rdt b 1 Dimère 70 CuSO4.5H2O (0,32 éq.) Acide ascorbique (0,96 éq.) DMF Micro-ondes a (85 min) 142 73% 2 Dimère 70 CuI (0,1 éq.) DIPEA (1,0 éq.) DMF TA - - 3 Monomère 67 CuIP(OEt)3 (0,1 éq.) DIPEA (2,0 éq.) Toluène Micro-ondesa (30 min) 141 95% 4 Dimère 70 CuIP(OEt)3 (0,1 éq.) DIPEA (2,0 éq.) Toluène Micro-ondesa (30 min) 142 traces 5 Dimère 70 CuIP(OEt)3 (0,1 éq.) DIPEA (2,0 éq.) DMF Micro-ondesa (30 min) 142 35%
a Les réactions sous micro-ondes sont menées à 85°C, sous une puissance de 50W – b Rendement en composé glycoconjugué après purification par chromatographie flash.
Tableau 8 – Conditions testées pour la réaction de CuAAC
La littérature rapporte que l’utilisation des micro-ondes pour les réactions de CuAAC peut souvent améliorer les conditions de réactions (temps, quantité de cuivre, rendements…). Il nous est donc apparu comme évident d’essayer d’appliquer cette méthodologie à la synthèse de nos composés afin d’essayer de rétablir le caractère catalytique de la réaction de CuAAC. Le dimère 70 a ainsi été traité en présence de 2,0 équivalents de sucre 114 dans le DMF173 selon les conditions décrites décrite pour l’essai 1 (Tableau 8). Le dimère glycoconjugué 142 est obtenu avec un rendement de 73% et l’utilisation des micro-ondes a permis de diviser par trois la quantité de cuivre, ce qui est relativement satisfaisant : cela correspond à 0,16 équivalent de cuivre par partenaire « alcyne », quantité que l’on peut qualifier de catalytique.
Par ailleurs, il est possible d’introduire le cuivre sous sa forme Cu(I), ce qui permet de s’affranchir de l’utilisation d’un agent réducteur comme l’acide ascorbique. Ainsi, le dimère 70 a été traité par 2,0 équivalents de sucre 114 dans le DMF173 dans les conditions décrites dans le Tableau 8 (essai 2). Après 18h de réaction, aucune trace de composé 142 attendu n’a été observée. Les quantités de CuI et de DIPEA ont donc été augmentées mais sans résultat. La coloration bleu-vert du milieu, signe de la présence de la forme oxydée Cu(II), a mis en évidence l’absence de Cu(I) nécessaire à la réaction de CuAAC.
123 Nous avons ensuite testé le CuIP(OEt)3180 comme source de Cu(I), préparé au laboratoire. Le monomère 67 est traité par 1,0 équivalent de sucre 114 dans le toluène dans les conditions décrites Tableau 8 (essai 3). Il est obtenu avec un excellent rendement. Malheureusement, ces mêmes conditions appliquées au dimère 70 n’ont pas fourni le composé souhaité, seules des traces ont été détectées lors du suivi de la réaction par CCM. Pensant que l’origine du problème résidait dans la faible solubilité du dimère 70 dans le toluène, nous avons appliqué des conditions identiques en changeant la nature du solvant : le toluène a été remplacé par le DMF (essai 4 – Tableau 8). Dans ces conditions, le dimère glycoconjugué 142 est obtenu avec un rendement modeste. Il semblerait que l’utilisation de CuIP(OEt)3 comme catalyseur de la réaction de CuAAC ne soit pas adapté dans notre cas.
(d)Désacétylation des unités saccharidiques
La désacétylation de l’unité saccharidique sur le monomère 141 est effectuée dans les conditions de désacétylation de Zemplén en présence de MeONa dans le méthanol anhydre (Na/MeOH). Malheureusement, le suivi de la réaction par CCM met en évidence la formation de trois composés.
Schéma 63 – Essai de désacétylation du composé 141
Des expériences complémentaires (Schéma 64 et Schéma 65) nous ont permis de déterminer l’origine de ces trois composés. La désacétylation des sucres a successivement été tentée sur l’acide 148 et sur l’amine 151, obtenus respectivement par traitement du monomère 141 en présence de TFA dans le dichlorométhane ou en présence de diéthylamine dans l’acétonitrile.
L’acide 148 a été soumis aux conditions de désacétylation en présence de MeONa dans le méthanol. Le suivi par CCM de la réaction a montré la formation de deux composés. L’étude par LC-MS du mélange obtenu a révélé la présence de deux produits désacétylés, dont un ne porte plus de groupement Fmoc. Ce dernier n’étant donc pas aussi stable que prévu
124 est éliminé en partie, ce qui représente un obstacle à la désacétylation des unités saccharidiques. La littérature rapporte des exemples où, dans de telles conditions, le groupement Fmoc est en partie éliminé, avec des conséquences non négligeables sur le rendement de la réaction.181
Schéma 64 – Essai de désacétylation du composé 148
La désacétylation a ensuite été testée sur l’amine 151, obtenue au départ du monomère 141 avec un rendement de 97% après purification par flash chromatographie. Le traitement de cette dernière par du MeONa dans le méthanol conduit également à un mélange de deux composés identifiés par LC-MS. Le composé majoritaire 152 est le produit de désacétylation attendu et le second est l’aspartimide 153.
Schéma 65 – Essai de désacétylation du composé 151
L’alternative envisagée a été la déprotection totale du composé 141 afin de procéder ensuite à la désacétylation. L’amine libre 151 est donc traitée par de l’acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane pour donner quantitativement l’aminoacide correspondant. Ce dernier est alors soumis à un traitement par du MeONa dans le méthanol pour donner quantitativement le composé déprotégé 150.
125 Schéma 66 – Désacétylation du composé 151
Ce procédé a donc été appliqué avec succès à l’ensemble de la série :
Schéma 67 – Désacétylation de l’ensemble des édifices glycoconjugués de la série « propargylamide »
Nous avons donc obtenu l’ensemble des composés glycoconjugués présentant les unités saccharidiques désacétylées avec de bons rendements.