Diffraction des rayons X

Les méthodes de diffraction, qui englobent la diffraction des rayons X, des neutrons (ND) et des électrons (ED) sont des techniques qui fournissent les informations les plus détaillées sur la structure tridimensionnelle d’une molécule. La diffraction des rayons X, plus particulièrement, est une technique d’analyse qui est réalisée à l’état solide, contrairement à toutes les techniques présentées précédemment. Elle est appliquée à l’étude de structures cristallines dont la taille peut descendre jusqu’à 10^-4 cm³. Cette méthode nécessite donc l’obtention de cristaux de la molécule, ce qui peut souvent être un obstacle, toutes les molécules ne cristallisant pas.

Les limitations de l’analyse par diffraction des rayons X résultent, d’une part, de la nécessité d’avoir un monocristal de la molécule étudiée et, d’autre part, du fait que les résultats obtenus ne représentent pas ceux d’une molécule isolée mais ceux de molécules sur lesquelles les forces du cristal s’appliquent.

166 A titre d’exemple, on peut citer les travaux de Gellman et col. qui ont obtenu des structures cristallines de deux β-peptides : un octamère dérivé du trans-(1R,2R)-ACPC⁶¹ et le tétramère dérivant du trans-(1R,2R)-ACHC : ⁶⁰

Figure 67 – Structures cristallines de β-peptides

Pour ces deux molécules, l’analyse par diffraction des rayons X a mis en évidence les similitudes de la structuration secondaire à l’état solide et en solution : le tétramère du trans-ACHC se replie en hélice H-14 et l’octamère du trans-ACPC en hélice H-12.

5- Modélisation moléculaire

La modélisation est devenue une technique incontournable dans l’étude des structurations secondaires de peptides et des protéines. En effet, elle permet d’accéder à des populations de conformations parmi lesquelles se trouve la conformation la plus stable, celle qui présente un minimum global d’énergie. Une étude par modélisation moléculaire peut se limiter à des calculs théoriques, avec ou sans contraintes théoriques imposées, mais elle peut aussi être menée en incluant des paramètres expérimentaux (angles dièdres, distances interatomiques issus d’expérience de RMN…) qui ont pour but de diminuer l’étendue de l’espace conformationnel. On appelle espace conformationnel l’ensemble des conformations que peut adopter une molécule.

On trouve principalement trois approches appliquées à l’étude de l’espace conformationnel d’une molécule de haut poids moléculaire.

167

La dynamique moléculaire

Cette méthode permet d’explorer l’espace conformationnel d’une molécule en appliquant les principes de la mécanique classique. Elle permet d’accéder rapidement aux populations de conformations après des calculs impliquant ou non des contraintes extérieures.

 Recuit simulé

Le recuit simulé entre dans la catégorie des méthodes de dynamique moléculaire. Cette technique permet d’accéder à la conformation de minimum global d’énergie en agissant sur la température et avec ou sans contraintes extérieures. La molécule est soumise à un cycle comprenant deux principales phases : une phase d’augmentation de la température et une phase de refroidissement lent. A l’issue de ce cycle, on obtient la conformation de minimum global d’énergie.

 Monte-Carlo

Cette méthode permet de générer aléatoirement un ensemble de conformations au départ d’une structure donnée. Cette méthode procède par cycle itératif. En effet, à chaque nouvelle conformation trouvée, si l’énergie potentielle de celle-ci est inférieure à l’énergie potentielle de la structure de départ, elle est alors considérée comme une nouvelle conformation de départ pour l’étape suivante. Cette approche permet de s’affranchir de la barrière d’énergie potentielle et permet ainsi d’accéder à la conformation de minimum global d’énergie.

De manière générale, de nos jours, la plupart des groupes de chercheurs travaillant à l’étude de structurations secondaires de β-peptides incluent une étude par modélisation moléculaire. Dans la majorité des cas, ces études sont conduites sous contraintes extérieures (RMN).

168

II- Analyse conformationnelle – Série « azoture »

1- Etude des oligomères

a- RMN

La RMN est la technique de choix, au cœur du processus de recherche conformationnelle. Elle permet d’établir des hypothèses qui peuvent être ensuite complétées par des données issues d’autres techniques.

Un préalable incontournable est l’attribution la plus complète possible des signaux des protons et des carbones qui composent la chaîne peptidique, mais également, si possible, des chaînes latérales qui peuvent donner des informations supplémentaires notamment en termes de distance issues d’effets nOe par exemple.

Il est donc crucial de trouver le meilleur solvant possible qui allie une bonne solubilité de l’ensemble des oligomères d’une série avec une bonne dispersion des différents signaux de la chaîne peptidique. Dans notre cas plus particulièrement, nous nous intéresserons aux zones des NH d’amide, des CαH et des CβH. On l’a vu, une bonne dispersion les signaux est, la plupart du temps, le signe qu’un oligomère adopte une structuration secondaire particulière. Nous avons testé différents solvants deutérés: le chloroforme CDCl₃, le méthanol-d₄ CD₃OD, le méthanol-d₃ CD₃OH, la pyridine-d₅ C₅D₅N et un mélange CD₃OD/C₅D₅N. A l’issue de ces essais, nous avons retenu le méthanol-d₃. C’est le solvant qui offre le meilleur compromis entre solubilité et dispersion des signaux. L’hexamère protégé à ses extrémités N- et C-terminales 94 présente une solubilité médiocre dans le méthanol-d₃, ne permettant pas l’enregistrement de spectres de bonne qualité. En revanche, son analogue déprotégé à l’extrémité N-terminale 95 est plus soluble et la bonne dispersion des signaux est maintenue.

Le pic résiduel de l’eau dans le méthanol-d3 étant très important, il a été nécessaire d’effectuer une présaturation de ce signal. Toutes les analyses (1D et 2D) dans CD3OH ont été effectuées sur un spectromètre 500MHz.

 Numérotation

La numérotation des atomes des molécules de la série « azoture » est résumée sur le schéma suivant en prenant pour exemple le tétramère 92.

169 Figure 68 –Numérotation pour la série « azoture »

i- Etude des spectres RMN 1D

Tous les oligomères ont été attribués le plus complètement possible malgré les recouvrements de signaux. Pour ce faire, nous avons utilisé une combinaison de différentes expériences de RMN à 2 dimensions (COSY, HSQC, HMBC, TOCSY). La Figure 69 présente les spectres ¹H du trimère 91, du tétramère 92 et de l’hexamère protégé 94 et de l’hexamère déprotégé au niveau de l’extrémité N-terminale 95 dans le méthanol-d3.

Le tableau suivant (Tableau 12) récapitule les déplacements chimiques des protons d’amide NH pour chaque oligomère. Les constantes de couplage ³J(NH,CβH) sont précisées entre parenthèses, les autres constantes de couplage n’ayant pas pu être déterminées. Dans tous les cas, nous avons attribué les signaux de la façon la plus complète possible mais les deux protons CαH (ProR et ProS) n’ont pas pu être différenciés du fait de la superposition des signaux correspondants.

Oligomère Résidu A Résidu B Résidu C Résidu D Résidu E Résidu F

Trimère 91 ^6,74 (8,3 Hz) 8,08 (8,1 Hz) 8,24 (8,0 Hz) ^{- -} - Tétramère 92 ^6,79 (8,5 Hz) 8,07 (8,1 Hz) 8,13 (8,0 Hz) 8,24 (8,0 Hz) ^- - Hexamère 94 ^6,89 7,71(1H) – 8,00 (2H) – 8,11(2H) Hexamère 95 (sel de TFA) ^- 7,65(9,0 Hz) – 8,03(9,1 Hz) – 8,12(8,8 Hz) – 8,26(8,7 Hz) – 8,32(8,3 Hz)

Tableau 12 – Déplacements chimiques et constantes de couplage ³J (NH, CβH) pour les oligomères de la série « azoture » dans CD₃OH

De façon générale, les spectres ¹H du trimère 91 et du tétramère 92 présentent une bonne dispersion des signaux dans la zone des NH (Figure 69). Les protons NHA (carbamate)

170 de ces deux oligomères présentent des déplacements chimiques similaires, naturellement différents des protons d’amide.

Si on compare les valeurs des déplacements chimiques des protons NH avec les données de la littérature,²⁰⁹ ces valeurs sont un peu faibles pour affirmer que ces protons sont engagés dans des liaisons hydrogènes fortes. Tout au plus, ils correspondent à des liaisons hydrogène intramoléculaire de faible intensité. En tout état de cause, dans CD₃OH, à la différence de CDCl₃, il n’est pas évident de statuer sur l’implication de protons NH sur la seule base de leurs déplacements chimiques.

C’est au stade de l’hexamère que l’on trouve les informations les plus intéressantes. Malgré une mauvaise qualité de spectre due à sa faible solubilité qui rend impossible l’attribution des signaux, on observe une très bonne dispersion dans la zone des CαH, et un profil de la zone des NH différent du trimère et du tétramère mais toujours aussi éclaté. Ces deux observations laissent envisager la présence d’une préférence conformationnelle au niveau de l’hexamère que l’on n’observe pas pour les oligomères plus courts. La meilleure solubilité de l’hexamère déprotégé 95 permet l’enregistrement d’un spectre de bien meilleure qualité, présentant une très bonne dispersion des signaux dans la zone des NH et des CαH. L’éclatement des signaux dans la zone des CβH n’est cependant pas optimal. L’étude de la zone des NH est particulièrement intéressante. On observe bien les signaux des cinq protons d’amide, très bien séparés. Les valeurs des déplacements chimiques de certains protons NH (8,12 – 8,26 – 8,32 ppm) sont cohérentes avec l’engagement de ces protons dans des liaisons hydrogène, en particulier le proton à 8,32 ppm. De plus, certaines constantes de couplage

3

J(NH,CβH) présentent des valeurs (9,0 et 9,1 Hz) qui peuvent correspondre localement à un arrangement antipériplanaire des protons NH et CβH concernés.

171 Figure 69 – Spectres ¹H (500 MHz) des oligomères de la série « azoture » dans CD₃OH

ppm (t1) 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1) 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1) 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1) 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0

zone des NH zone des C_βH zone des C_αH

Trimère 91

Tétramère 92

Hexamère 94

Hexamère 95

172

 Tétramère

Dans le cas du tétramère 92, on constate la présence d’épaulements au niveau de certains protons, notamment des NH, des CαH et des protons de l’ester méthylique et du groupement Boc (Figure 70).

Figure 70 – Zone des NH du tétramère 92

Afin de statuer sur l’origine des épaulements observés, à savoir s’il s’agit d’une impureté ou d’une conformation stable minoritaire en équilibre, nous avons procédé à une expérience en température. Les spectres, enregistrés à 25°C, 30°C, 40°C, 50°C et 60°C sont représentés sur la figure suivante (Figure 71).

On peut observer une disparition progressive des épaulements avec l’augmentation de la température. De même, on observe une simplification des signaux dans la zone des CαH. Ceci tend à montrer que la RMN révèle la présence de deux conformations dont l’une reste minoritaire. En effet, si on avait été en présence d’une impureté, une variation de température n’aurait pas dû avoir d’effet. D’autre part, le lot dont ce tétramère 92 est issu a été purifié par HPLC préparative en phase inverse, ce qui est un gage supplémentaire de pureté (HPLC > 99%).

L’expérience en température nous permet également d’étudier le comportement intrinsèque du tétramère en fonction de la température (Figure 72). L’amplitude des variations de déplacements chimiques fournit des informations sur l’implication des protons dans des liaisons hydrogène. De façon générale pour le tétramère, on peut constater un déplacement de l’ensemble des signaux des protons NH vers les champs forts. Le fait que tous les signaux voient leur déplacement chimique diminuer de manière significative semble indiquer une absence de structuration. En effet, dans le cas contraire, les protons engagés dans des liaisons hydrogène verraient leur déplacement chimique être légèrement modifié en fonction de la température. Il peut tout de même être intéressant de calculer leur coefficient de température. Pour cela, il suffit pour chaque NH de rapporter sur un graphe les valeurs des déplacements

173 chimiques en fonction de la température. La pente de chaque droite fournit le coefficient de température de chaque proton NH.

Figure 71 – Etude en température par RMN (400 MHz) du tétramère 92 dans CD3OH

Figure 72 – Graphe δ (ppm) = f[T(°C)] pour le tétramère 92 dans CD3OH

ppm (t1) 6.50 7.00 7.50 8.00 ppm (t1) 6.50 7.00 7.50 8.00 ppm (t1) 6.50 7.00 7.50 8.00 ppm (t1) 6.50 7.00 7.50 8.00 ppm (t1) 6.50 7.00 7.50 8.00 6 6,5 7 7,5 8 8,5 20 30 40 50 60 70 δ ( p p m ) T (°C) résidu A résidu B résidu C résidu D 25°C 30°C 40°C 50°C 60°C

174 Les évolutions sont parfaitement linéaires (coefficients de corrélation des droites R²≥

0,997). Les coefficients de température des différents protons NH sont reportés dans le tableau suivant.

NHA NHB NHC NHD

C. T. (ppb/°C) -10,6 -6,9 -7,4 -7,7

Tableau 13 – Calcul des coefficients de température des NH du tétramère 92 dans CD₃OH

Ainsi, les coefficients de température des différents protons NH sont tous négatifs, ce qui est normal, mais ils sont tous inférieurs à -6 ppb/°C. Rappelons qu’il est admis que les protons dont le coefficient de température est supérieur à -6 ppb/°C sont susceptibles d’être engagés dans des liaisons hydrogène. Dans notre cas, le proton NHA présente un C.T. très éloigné des autres, ce qui met en évidence le comportement bien différent d’un proton NH de carbamate en comparaison avec les NH d’amide. Les protons NHB, NHC et NHD ont des coefficients de température proches mais inférieurs à la valeur charnière. Cette observation, corrélée aux valeurs des déplacements chimiques de ces protons à température ambiante pourrait laisser supposer qu’ils ne sont pas engagés dans des liaisons hydrogène.

Il semblerait donc qu’on soit plutôt en présence d’un équilibre entre plusieurs conformations dont deux seraient plus stables que les autres, mais apparemment pas stabilisées par liaisons hydrogène.

175 ii- Etude des corrélations dipolaires (effets nOe)

 Tétramère 92

L’expérience de NOESY a été réalisée avec un temps de mélange de 500ms. Les corrélations auxquelles nous nous intéressons plus particulièrement peuvent être classées en trois catégories et sont définies sur la carte 2D suivante :

Figure 73 – Carte de NOESY (500 MHz) du tétramère 92 dans CD₃OH

L’étude des différentes zones de la carte 2D va nous permettre de voir précisément les corrélations dipolaires existant au sein du tétramère 92.

NH-CαH

176

 Zone NH-CαH

Un agrandissement de la zone de corrélation dipolaire NH-CαH est représenté sur la Figure 74.

Figure 74 – Zone de corrélation NH-CαH

Les tâches de corrélation I, II, III et IV de forte intensité correspondent à des nOe à courte distance, de type NH_i-CαH_i un sein d’un même résidu. En revanche, la tâche V correspond à une corrélation nOe de type NHi-CαHi-1 ou NHi-CαHi-2. Le recouvrement des signaux CαH_B et CαH_C rend impossible toute distinction entre les deux résidus.

I II III IV V C_αH_D C_αH_A C_αH_B C_αH_C NH_C NH_B NH_A NH_D

177

 Zone NH-CβH

La zone de corrélation NH-CβH est représentée sur la Figure 75.

Figure 75 - Zone de corrélation NH-CβH

Les tâches de corrélation I, II, III, IV de forte intensité représentent des nOe de type NH_i-C_βH_i un sein d’un même résidu. Les tâches V et VI, en revanche, correspondent à des corrélations inter-résidus. La tâche de corrélation V de moyenne intensité correspond à un nOe de type NH_i-C_βH_i-1 (NH_B ↔ C_βH_A). On observe également un nOe de faible intensité de type NHi-CβHi-2 (NHC ↔ CβHA). Cette dernière corrélation, bien que de faible intensité dénote une certaine proximité spatiale de ces deux protons, ce qui suggère un début de repliement de la molécule.

 Zone CαH- CβH

Cette zone n’est pas informative puisque les seules tâches observées correspondent à des corrélations intra-résidu.

NH_C NH_B NH_A NH_D III C_βH_A C_βH_D C_βH_B C_βH_C I II IV V VI

178

Conclusion

Les différentes corrélations nOe observées sont résumées sur la Figure 76. Les corrélations pour lesquelles un doute subsiste sont réprésentées en pointillés.

Figure 76 – Corrélations nOe inter-résidus observées sur le tétramère 92 dans CD₃OH

b- Infrarouge

Afin d’apporter des preuves supplémentaires aux observations faites à l’issue des expériences de RMN 1D et 2D et de dichroïsme circulaire, nous avons entrepris une étude de la série d’oligomères par spectroscopie infrarouge. Comme évoqué précédemment, ceci devrait nous permettre de mettre en évidence la présence de liaisons hydrogène intramoléculaires.

Le spectre de chaque composé C est obtenu par traitement informatique par soustraction du spectre du solvant pur S au spectre de l’échantillon C+S.

ݏ݌݁ܿݐݎ݁ሺܥሻ = ݏ݌݁ܿݐݎ݁ ሺܥ + ܵሻ − ݏ݌݁ܿݐݎ݁ ሺܵሻ

Les spectres ont été enregistrés dans le chloroforme, de qualité spectroscopique (Acros Organics), stabilisé avec de l’amylène et non pas avec de l’éthanol dont la bande OH proche de celles des NH, qui nous intéressent, rend difficile la soustraction du spectre du solvant. Nous avons également testé l’acétonitrile qui ne nous a pas permis d’obtenir des spectres de qualité.

Les échantillons ont donc été préparés par dissolution dans le chloroforme à des concentrations connues. La concentration usuellement utilisée dans la littérature est de 2 mM. Il a cependant été nécessaire de préparer des échantillons beaucoup plus dilués pour le tétramère 92 et l’hexamère 94 du fait de leur très faible solubilité dans le chloroforme.

― NHi ↔ CαHi-1

― NH_i ↔ CαH_i-2

― NH_i ↔ CβH_i-1 ― NH_i ↔ C_βH_i-2

179 Oligomère Concentration (mM) Monomère 85 7,3 Dimère 88 2,0