b- RMN à deux dimensions (RMN 2D)
2- Dichroïsme Circulaire (DC)
Le dichroïsme circulaire est une technique utilisée pour l’élucidation des structures secondaires des protéines et des peptides. Le DC est une méthode chiroptique nécessitant que la molécule analysée présente une activité optique. La première utilisation pratique de cette technique est rapportée en 1965 par Holzwarth et Doty200 et concernait l’étude d’une hélice α. Avec le temps, le DC est devenu une technique de routine employée pour la détermination de structures secondaires de peptides, de protéines, d’acides nucléiques et d’oligo- ou polysaccharides.
Quand la lumière traverse une substance optiquement active possédant un ou plusieurs chromophores, non seulement les vitesses des composantes droite et gauche d’un faisceau de lumière polarisée deviennent différentes, aboutissant à deux longueurs d’onde différentes, mais ces deux composantes sont aussi absorbées avec deux amplitudes différentes.201 En effet, de manière générale, la vitesse des deux ondes lumineuses est diminuée par l’interaction avec la molécule chirale. Une de ces ondes (droite ou gauche) est cependant plus retardée que l’autre, ce qui génère une nette bande d’absorption.202 Cette différence entre les absorptions est appelée dichroïsme circulaire DC et peut être défini par la formule suivante.
160 où ܣ et ܣௗ désignent respectivement les absorbances des composantes gauche (g) et
droite (d) du faisceau de lumière circulairement polarisée. L’absorbance étant définie par la loi de Beer-Lambert, on arrive à la définition suivante du DC :
ܦܥ = ߝ. ݈. ܥ − ߝௗ. ݈. ܥ d’où ܦܥ = ∆ߝ. ݈. ܥ
où ∆ε est la différence d’absorption molaire, soit la différence des coefficients
d’extinction
l est le chemin optique parcouru par la lumière à travers l’échantillon (cm) C est la concentration de l’échantillon (mol.L-1)
L’équation précédente met en évidence le fait que le DC ne peut être mesuré qu’en correspondance avec des bandes d’absorption. Ce qu’on observe sur le spectre est un pic dichroïque, appelé effet Cotton, du nom de son découvreur.203
Le dichroïsme circulaire est mesuré par l’ellipticité θ. Le terme d’ellipticité fait référence à la forme elliptique prise par le vecteur électrique lorsqu’une des deux formes de la lumière est absorbée par l’échantillon de manière différente de l’autre forme. La trajectoire de la lumière devient au fur et à mesure une ellipse.
161 La lumière, de nature ondulatoire, voit sa trajectoire progressivement devenir elliptique (Faisceau bleu – Figure 64). Cette ellipticité est transformée à chaque longueur d’onde en une valeur qui dépend de la masse molaire de l’échantillon, de sa concentration et du chemin optique selon la formule suivante.204 Cette valeur est appelée ellipticité molaire :
ሾߠሿ =ߠ. ܯ݈. ܥ
avec ሾߠሿ est l’ellipticité molaire (deg.cm-2
.dmol-1)
ߠ est l’ellipticité (mdeg)
M est la masse molaire (g.mol-1) l est le chemin optique (mm)
C est la concentration de l’échantillon (g.L-1)
Pour la comparaison d’oligomères appartenant à la même série, il est nécessaire de normaliser la valeur de l’ellipticité molaire en la convertissant en ellipticité par résidu :
[ ]
MRE n C l M res = = . . .θ
θ
où
[ ]
θ res est l’ellipticité par résidu (deg.cm2.dmol-1), notée MRE (Main Residue Ellipticity)݊ est le nombre de résidus
Plusieurs solvants peuvent être utilisés pour solubiliser l’échantillon à analyser. Cependant, la transparence du solvant dans la gamme de longueur d’onde étudiée est essentielle afin de ne pas altérer les informations collectées.
Le DC est une technique très sensible : il est possible d’enregistrer les spectres de DC pour des échantillons de concentrations 10-6 mol.L-1.
Dans le cas des peptides, la liaison peptidique constitue un chromophore qui absorbe dans l’UV lointain vers 220 nm (transition n→π*) et vers 140 nm et 190 nm (transition
π→π*). La transition n→π* d’une liaison amide, bien que faible (εmax < 100) possède une énergie relativement sensible à la formation de liaison hydrogène. Les chromophores présents sur les chaînes latérales peuvent également avoir une influence sur le DC.
L’ellipticité dépend de la conformation de la molécule. Les structures ordonnées telles que les hélices, les feuillets et les coudes, présentent un macrodipôle qui leur est
162 caractéristique qui génèrera des absorptions qui lui seront propres. Ainsi, le spectre de DC sera caractéristique d’un certain type de structure (Figure 65).
Cependant, une étude théorique menée par le groupe de Seebach a montré que des spectres de DC similaires pouvaient résulter de différentes conformations.205 C’est pourquoi les observations faites sur la base d’un spectre de DC doivent être corrélées à des résultats issus d’autres expériences, notamment de RMN ou de diffraction des rayons X quand cela est possible. Il n’en reste pas moins que l’étude par DC d’un oligomère peut, dans un premier temps, renseigner sur l’existence ou l’absence d’une préférence conformationnelle. La présence de plusieurs structures ordonnées peut d’ailleurs être observée à l’intérieur d’un même spectre.206
Figure 65 – Profil de dichroïsme circulaire dans le méthanol en fonction du type d’hélice
3- Infrarouge
La spectroscopie infrarouge est l’une des plus anciennes techniques expérimentales utilisées pour l’analyse des structurations secondaires des polypeptides et des protéines. Plus particulièrement, la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) permet la mesure de la longueur d’onde et de l’intensité de l’absorption d’une radiation IR par un
163 échantillon. De façon générale, dans le cas des polymères, les données expérimentales sont interprétées en termes de vibration d’unité structurale répétitive qui donnent naissance à neuf bandes d’absorption caractéristiques relatives à la liaison peptidique et qui sont résumées dans le tableau suivant.207
Bande caractéristique Nombre d’onde
approximatif (cm-1) Description
Amide A 3300 NH élongation
Amide B 3100 NH élongation
Amide I 1600-1690 C=O élongation
Amide II 1480-1575 CN élongation
NH déformation
Amide III 1229-1301 CN élongation
NH déformation
Amide IV 625-767 OCN déformation
Amide V 640-800 NH déformation hors du plan
Amide VI 537-606 C=O déformation hors du plan
Amide VII 200 Torsion du squelette
Tableau 10 – Bandes de vibration associées à une fonction amide
La présence de structuration secondaire, stabilisée par des liaisons non covalentes de type liaisons hydrogène, va pouvoir être mise en évidence par l’observation de deux bandes vibrationnelles principales : la bande Amide I et la bande Amide A.
a- Amide I
La région du spectre la plus sensible au phénomène de structuration secondaire est la bande Amide I, qui correspond à la bande de vibration d’élongation de la liaison C=O de la liaison peptidique. Chaque type de structuration secondaire va générer une fréquence de vibration différente, due en particulier à une géométrie tridimensionnelle unique et aux liaisons hydrogène mises en jeu. Ainsi, un groupe de chercheurs, travaillant sur des protéines dans H2O et D2O, a mis en évidence une certaine corrélation entre la fréquence de la bande Amide I et le type de structuration adopté par les protéines.207
164 Tableau 11 – Corrélation entre nombre d’onde et structuration secondaire
b- Amide A
Par ailleurs, il est connu que lorsque la vibration d’une liaison NH (Amide A) est perturbée par quelque interaction ou par son implication dans une liaison hydrogène, la fréquence d’élongation de cette liaison se trouve diminuée. En opérant en solution très diluée dans un solvant inerte, les molécules d’échantillon ne seront ni agrégées ni en interaction avec le solvant. Il sera donc possible de distinguer deux zones dans la région Amide A : une zone de plus basse fréquence correspondant aux bandes des liaisons NH engagées dans des liaisons hydrogène et une zone correspondant aux bandes vibrationnelles des liaisons NH libres.208
A titre d’exemple, on peut citer les travaux de Seebach et coll. qui ont étudié l’évolution du spectre IR en solution dans le chloroforme (concentration 5 mM) d’une série de
β2,2-oligomères dérivant de l’acide 1-(aminomethyl)cyclopropane-carboxylique.52 Les auteurs ont montré que l’hexamère de cette série se repliait en hélice H-8.
165 Figure 66 – Evolution du profil IR (zone des NH) pour une série d’oligomères
On observe une évolution nette au niveau des bandes NH Amide A. Le dimère (n = 1) présente deux bandes distinctes : une bande de forte intensité à 3446 cm-1 correspondant à l’élongation d’une liaison NH libre et une bande beaucoup plus faible à 3344 cm-1. Cette dernière bande suggère la présence de liaisons hydrogène faible. Au fur et à mesure que la chaîne peptidique s’allonge, cette deuxième bande voit sa fréquence diminuer et son intensité augmenter. Ceci traduit typiquement la présence de liaisons hydrogène de plus en plus fortes.