Remarques sur le matériel

En fonction de la nature des échantillons, il y a nécessité d'adaptation à chaque étape de la méthode citée ci-dessus.

Tout d'abord, pour la méthode de base plusieurs observations ont été faites :

 Plus l'échantillon est dur ou très compact, plus le temps de réhydratation est important et,

après observation personnelle, plus la quantité de glycérol sera augmentée.

 Le temps d'agitation de la préparation est fonction de la constitution de l'échantillon. Plus

le complexe formé par la phase minérale et la phase organique est dense, plus la durée d'agitation est importante. Cette manipulation va permettre de libérer les œufs contenus dans le complexe.

Pour certains échantillons, il a donc fallu également adapter le protocole en ajoutant (ou en supprimant) des étapes. Lors de la décomposition du cadavre et jusqu'à l'arrêt de celle-ci par la momification, les "jus" de décomposition des organes cibles du point de vue parasitaire ont sédimenté et ont imprégné les tissus sous-jacents.

En Nubie, comme en Egypte, et plus précisément à Saqqara avec la jarre de rejet d'embaumement, les linges, les moelles de papyrus, les bandelettes, les linceuls se sont révélés riche en éléments parasitaires.

Etude microscopique. échantillon Phosphate trisodique 0,5% + Glycérol 5% 48 heure minimum 315 µm 160 µm 50 µm 25 µm Rincer à l’eau 315 µm 160 µm + Formol 10% 50 µm ^{+ Formol} 25 µm

-Broyage de la solution au mortier et pilon -Passage aux ultrasons (5 minutes) -Passage au tamis :

-Récupération du 1er jus.

-Passage à l’agitateur des 4 tamis superposés. -Récupération du contenu de chaque tamis :

-Réhydratation

MATERIELS

- La flottation

Lors de la préparation de certains échantillons par sédimentation, puis au cours de la lecture microscopique, l'étude a été gênée par une concentration importante d'éléments non-parasitaires qui rendaient difficile la lecture. Afin de rendre la solution observée plus claire et moins surchargée, nous avons eu recours à la technique de flottation de Fülleborn, modifiée par Willis en 1921 (Bailenger, 1982). Les œufs fossilisés ou en voie de fossilisation ont une densité inférieure à celle d'un œuf vivant. Il n'est donc pas possible d'appliquer la méthode de flottation classique utilisée en diagnostic coprologique médical. Elle a été adaptée aux échantillons étudiés. Cette méthode fait intervenir la notion de poids spécifiques des œufs : généralement, ces éléments ne flottent pas dans l'eau ordinaire du fait de leur poids spécifique qui est sensiblement supérieur à 1. Si les échantillons à observer sont mis en suspension dans un liquide ou une solution de poids spécifique supérieur au leur, ils vont flotter à la surface parce qu'il y aura une différence de densité entre la solution et les éléments.

Chaque échantillon est réhydraté selon la technique décrite précédemment. Une certaine quantité de la solution préparée est placée dans un tube à centrifugation, puis recouverte par un même volume de la solution de Willis saturée (solution de sels alcalins : chlorure de sodium) de densité 1,20. Le mélange ainsi obtenu doit arriver à ras bord et former un ménisque. A la surface de ce dernier est déposé une lamelle. Il ne doit pas y avoir formation de bulles d'air entre le ménisque et la lamelle. Au bout d'une minute, la lamelle est retirée et remplacée par une autre. Au niveau de la première lamelle, des débris sont observables. La manipulation est ainsi répétée avec des intervalles de temps de dépôts de lamelles augmentant progressivement de une à trois minutes. Le tube est ensuite centrifugé pendant trois minutes à 1550 tours/minutes. L'observation microscopique se fait dans le culot obtenu après centrifugation (Centrifugeuse Bioblock Scientific/mlw T5).

Cette technique est fonction de l'état de conservation des œufs des espèces parasitaires et varie selon la nature des sédiments encaissants. Cette grande diversité implique la mise au point et le choix de techniques adaptées au matériel ancien utilisant différentes solutions de densité allant de 1,05 à 1,4.

œufs dans un contexte archéologique précis, il deviendrait difficile de tester toutes les solutions à densités différentes pour isoler les œufs de parasites.

Dans cette étude, la flottation a été tentée, mais les résultats sont trop d'aléatoire. Cependant, cette méthode a été utilisée afin d'éclaircir certaines préparation excessivement riche en élément fibreux (bouchon), végétaux (moelle de papyrus), … Les différentes lamelles posées à des temps variables permettent la récupération d'une quantité non négligeable de fibres, de fragments végétaux, … et donc facilite la lecture microscopique.

Toutefois certaines difficultés subsistent:

- Les liquides utilisés imprègnent les œufs qui vont s'alourdir et sédimenter

au bout de 10 à 30 minutes selon la solution, il faut donc hâter la manipulation et l'observation.

- Les liquides altèrent légèrement la morphologie des œufs provoquant des

déformations, il faut donc avoir l'habitude de les reconnaître dans de telles conditions pour les identifier.

- La perméabilité de la coque pour les œufs en voie de fossilisation diffère de

celle des œufs actuels. Cette différence est donc à gérer tout au long d'une l'étude.

- M.I.F enrichissement

La méthode du MIF enrichissement a été appliquée sans modification du protocole de base (cf. Chapitre V). Celle-ci n'a pas donné les résultats attendus. La recherche des kystes de Protozoaires dans les échantillons de l'Ile de Saï s'est avérée totalement négative. Il semble que seule les techniques immunologiques pourront permettre d'ajouter à la liste des parasites, les Protozoaires.

2.1.5 Enregistrement des résultats

Les techniques utilisées dans ce travail sont celles du diagnostic de coprologie parasitaire actuelle. De ce fait, avant toute analyse, il a été nécessaire d'approcher, puis d'intégrer des méthodes de bases de parasitologie.

Il est important de noter que toutes notions de contaminations par des échantillons actuels, ou par des échantillons archéologiques de sites et d’époques différentes sont prises en comptes dès le début du travail. Chaque échantillon est enregistré à son arrivée et plus particulièrement au moment de son traitement. Une fiche de préparation (tableau 30) est remplie de la manière suivante :

SITES ^{Date de} réhydratation Date de traitement COLONNE 1 COLONNE 2 COLONNE 3 NOM X Y ^Echantillon n1 Echantillon n2 Echantillon n3 NOM V W ^Echantillon n1 Echantillon n2 Echantillon n3

Tableau 30 - Fiche d’enregistrement et de traitement des échantillons archéologiques

Après chaque utilisation d'un mortier, d'un pilon, d’une colonne de tamis, ceux-ci sont passés aux ultrasons pendant 15 min à 60°C afin d’éliminer tous les résidus, et éviter ainsi toute pollution.

Lors de l’observation, si des concordances étranges apparaissent entre deux sites différents, un contrôle des dates de préparation est fait. Ainsi, deux sites, traités à 1 semaine d’intervalle, peuvent présenter des similitudes parasitaires, mais ne pas s’être « contaminé » l’un l’autre.

Chaque prélèvement réalisé pour observation est fait avec une seule et même pipette Pasteur pour un échantillon donné. Chaque pipette, lame et lamelle sont jetées

Les échantillons archéologiques ne sont jamais en contact avec du matériel actuel.

Les œufs, les embryophores, les éléments parasitaires (s.l.) sont observés entre lame et

lamelles au microscope photonique. Chaque microscope est équipé d'oculaires de grossissement variables : 10, 40, 60 et 100. La recherche sur la lamelle (22 X 22 mm) des marqueurs parasitaires se fait au grossissement 10. Une fois l'élément repéré, identifié ou non,

d'analyse d'images semi-automatique : le lecteur SAISAM (Microvision Instruments). Ce logiciel informatique permet de mesurer, d'annoter et de documenter les images qui sont ensuite enregistrées. Les images (grossissement X400, X600 et X1000) sont les seules preuves de la présence des pathologies dans les échantillons.

Le microscope permet également d'appréhender le "paysage" de chaque échantillon, c'est-à-dire, de noter la présence de pollens, de spores de champignons, de fibres végétales, de phytolithes, d'éléments divers (ANNEXE III)

Le premier problème rencontré est celui du manque de standardisation dans les études de paléoparasitologie de part le monde. Depuis les premiers travaux en 1910 (Ruffer), un grand nombre d'essais a été réalisé. Et un grand nombre de protocoles d'étude et d'analyse a

été proposé (Reinhard et al., 1988 ; Reinhard, 1990 ; Araujo et al., 1998 ; Allison et al., 1999

; Bouchet et al., 2003a). C'est une trop grande variabilité dans les méthodes qui ont amené

chaque laboratoire à travailler à sa manière (cf Chapitre I). Pour traiter les échantillons archéologiques, les techniques ont été progressivement adaptées, au laboratoire, et ceci pour chaque sorte de prélèvement. Après un travail sur l'actuel, et analysant de nouveaux types d'échantillons, il a fallut encore adapter certaines de ces méthodes.

L’étude de chaque échantillon archéologique se fait, au microscope optique entre lame et lamelles, à raison de 20 lamelles par échantillon. L'expérience a montré que la lecture d'un nombre supérieur de lamelle (40 pour les premières observations) ne peut apporter que des informations d'ordre quantitatif inexploitables. En effet, si un grand nombre d'œufs est observé dès les premières lamelles, la lecture de lamelles supplémentaires ne pourra que confirmer les premières données, c'est-à-dire, une présence importante du type parasitaire

(exemple de SN-T.175). En paléoparasitologie, la notion de quantité ne peut être de mise

car, le nombre d'œufs présent dans un échantillon est fonction d'un grand nombre de variables: le rythme nycthéméral de ponte du parasite, le degré d'infestation du sujet (humain ou animal), les conditions de conservation, de lessivage du matériel, la quantité d’échantillon analysée, etc... (Jones, 1982). L'observation microscopique est donc principalement fondée sur une

notion qualitative. En aucun cas, une étude statistique de la représentation parasitaire d'un échantillon n'est envisageable.

Face aux organes et aux tissus, des méthodes encore inexploitées au laboratoire ont été envisagées. En effet, la recherche d'élément parasitaire, au niveau d'un tissu ne peut se faire que par histologie, immunologie,…. Les tentatives de coupes et d'études du matériel cérébral

au M.E.T ne se sont pas révélées concluantes. Il semble que le cerveau ne soit pas un organe ayant une conservation parfaite de ses structures internes. Pour la peau et les muscles, des études en histologie avec coloration ont montré une dégradation importante des cellules. Les études sont toujours en cours.

2.2 Protocole de base pour les techniques électroniques et

immunologiques

Une technique a été utilisée pour une observation à plus petite échelle :

- La Microscopie Electronique à Balayage

- Les techniques immunologiques