RejectMCSPDUUltimatum

Considerando a importância da porção glicosídica e as dificuldades envolvidas no processo de glicosilação seletiva sintética de flavonoides, uma triagem virtual clássica baseada em ligante foi realizada. O objetivo principal dessa metodologia foi a de encontrar fragmentos com características estruturais similares e sinteticamente viáveis. Os fragmentos que demonstraram resultados de similaridade 3D mais altos em relação aos glicosídeos apresentaram um ou mais aneis aromáticos e uma grande quantidade de grupamentos com características polares.

Os filtros que levaram em consideração a similaridade e simplicidade estrutural permitiram a seleção de dois principais fragmentos como possíveis substitutos da região glicosídica. Os valores obtidos de score de similaridade para o fragmento 1 (F1) e fragmento 2 (F2) foram de 0,83 e 0,81, respectivamente. De fato, ambos apresentaram sobreposição promissora em relação aos glicosídeos (Figura 25). Asemelhança de ocupação espacial permitiu a realização de possíveis interações intermoleculares semelhantes. Dentre elas, é possível destacar ligações de hidrogênio com os resíduos de aminoácido GLN 267 e, principalmente, com o solvente externo ao sítio S. Adicionalmente, ambos os fragmentos podem realizar uma interação hidrofóbica do tipo π-stacking paralela entre o anel aromático presente nos blocos de construção e o resíduo PHE 264, sendo melhor posicionada em F2 (Figura 25B).

Figura 25: Fragmento 1 (A) e fragmento 2 (B) sobrepostos ao bloco glicosídico de BP1 (verde). Fonte: Dados experimentaias.

Dentre os dois fragmentos, F2 se destaca por apresentar um anel triazólico em sua estrutura. Esse grupamento químico é amplamente citado por sua bioatividade, sendo aplicado na construção de entidades moleculares utilizadas para o tratamento de diversas doenças. Sua ampla utilização se deve em grande parte à sua capacidade de formar diferentes interações intermoleculares com vários receptores terapeuticamente relevantes (TOTOBENAZARA;

BURKE, 2015). Vale ressaltar que existem várias metodologias sintéticas descritas para a sua obtenção, o que o torna uma estrutura versátil e acessível em termos sintéticos (FOREZI et al., 2018).

Existem ainda estudos que demonstraram a capacidade de inibição de PDE4 por derivados triazólicos (LI et al., 2016; NALLAPATI et al., 2015; PRAVEENA et al., 2014). A exemplo, um derivado 1,2,4 triazólico (Figura 26A) demonstrou uma atividade inibitória significativa em PDE4 (IC50=1,2 µM) e consequente bloqueio da liberação do fator de necrose

tumoral (TNF) induzida por lipopolissacarídeos (LPS) (LI et al., 2016). Já o derivado 1,2,3 triazólico (Figura 26B) apresentou inibição de PDE4B superior a 50% em uma concentração de 30 µM e mostrou propriedades citotóxicas importantes em células de câncer de pulmão A549 in vitro com IC50 de 8,7 µM (PRAVEENA et al., 2014). É possível concluir que o uso

desse grupamento se torna promissor para o desenho de potenciais novos inibidores de PDE4.

Figura 26: Derivados triazólicos com atividade inibitória em PDE4. Fonte: Autoria própria.

Após a análise primária no sítio, o fragmento foi modificado visando a realização do maior número possível de interações intermoleculares. Posteriormente, para confirmar a possibilidade de substituição do fragmento glicosídico de BP1 por F2 modificado, simulações de dinâmica molecular com a quercetina acoplada a esse fragmento (G1_1) foram realizadas. A permanência do núcleo flavonoidico possibilitou a observação da influência apenas do fragmento escolhido na interação entre o composto e o sítio ativo da enzima PDE4B. O tempo total de simulação foi baseado no comportamento do complexo apontado através do gráfico de RMSD e teve como objetivo realizar o refinamento das interações intermoleculares.

O gráfico de RMSD do composto construído demonstrou estabilização completa da estrutura já no início da simulação, por volta de 1,5 ns (Figura 27). Não houve alterações significativas de conformação no tempo restante de simulação. Sendo assim, mesmo com um período total de simulação curto, foi possível obter um complexo mais otimizado e estabilizado para o estudo das interações intermoleculares.

Figura 27: Gráfico RMSD de simulação com G1_1. Fonte: Dados experimentais.

Os resultados após o período de simulação de dinâmica molecular permitiram concluir que houve a preservação de grande parte das interações intermoleculares realizadas anteriormente por BP1. Dentre elas, é importante destacar a permanência da dupla interação hidrofóbica do tipo π-stacking paralela com os resíduos PHE 296 e PHE 264, presentes no sítio Q e essencial para a atividade inibitória. Além disso, também foi observada a preservação da ligação de hidrogênio com o resíduo GLN 293 que auxilia na estabilidade do composto no sítio ativo (Figura 28). A conservação dessas interações demonstra que a inserção do fragmento não gerou grandes modificações em relação a ocupação geral do composto em relação à presença dos glicosídeos. Esse fato, essencialmente, se deve pela semelhança estrutural entre ambos. Além disso, o fragmento possui uma grande quantidade de átomos que podem participar da realização de ligações de hidrogênio, principalmente com o solvente externo ao sítio S.

Figura 28: Interações realizadas entre o análogo construído (G1_1), em azul, e os resíduos de aminoácido de PDE4B.

Fonte: Dados experimentais.

Apesar de promissor em termos de interação molecular, o análogo construído apresenta ainda desvantagens em termos sintéticos. A principal razão se deve ao núcleo flavonoidico ser a quercetina que possui uma grande quantidade de hidroxilas livres e reativas (Figura 29). Como resultado, o acoplamento seletivo do fragmento baseado em F2 na hidroxila ligada a C-3 se apresenta como um obstáculo na obtenção do composto G1_1, tornando o processo pouco viável devido ao custo operacional e tempo de laboratório envolvidos.

Figura 29: Estrutura do análogo G1_1 com destaque para as hidroxilas reativas da quercetina Fonte: Autoria própria

Baseado nessa informação outros núcleos foram propostos para substituir a quercetina. De acordo com a ocupação do flavonoide no sítio ativo de PDE4, é necessário que

o anel aromático A sempre esteja presente na estrutura por interagir diretamente com os resíduos de fenilalanina. Quanto aos seus substituintes, a hidroxila presente na posição 5 não realizou interações intermoleculares, o que torna sua presença não necessária. Já a hidroxila ligada ao carbono 7 desse mesmo anel realiza ligações de hidrogênio que podem contribuir com a estabilidade do composto no sítio ativo e pode ser substituída por qualquer outro grupamento com características polares. O anel B não realiza interações com os resíduos de aminoácido do sítio de PDE4, mas fornece a distância necessária para que o anel C ocupe o sítio M. Por fim, os substituintes presentes no anel C interagem indiretamente com os metais bivalentes através de ligações de hidrogênio com moléculas de água e também podem ser substituídos por grupamentos polares. De forma resumida, as informações utilizadas na proposição dos núcleos baseados na quercetina são ilustradas na figura abaixo.

Figura 30: Relação estrutura-atividade da quercetina considerando sua ocupação nos sítios da enzima PDE4B. Fonte: Autoria própria.

A rota dos análogos de BP1 foi então elaborada com base em F2 e nas informações descritas acima. Para isso, foi realizada uma pesquisa envolvendo o custo de cada reagente, de modo a garantir a obtenção de compostos com menor impacto econômico possível. Adicionalmente, foram elaboradas análises retrossintéticas. A proposta final de rota geral sintética (Figura 31) apresenta ainda chalconas (b) como intermediárias uma vez que essa subclasse de compostos apresenta diversos relatos de atividade farmacológica, incluindo inibição em PDE4 (DÍAZ-TIELAS et al., 2016; SELVARAJ et al., 2018).

Figura 31: Rota sintética geral para a obtenção de análogos de BP1. Fonte: Autoria própria.

Vale ressaltar que a variação dos substituintes, representados por R, é proveniente da substituição do aldeído utilizado na síntese dos compostos. Nesse estudo, os aldeídos (a) foram selecionados de acordo com suas características estruturais que necessariamente foram similares às consideradas necessárias pelo estudo prévio de modelagem molecular. Além disso, os aldeídos utilizados possuem baixo custo comercial, permitindo a reprodução em larga escala posteriormente. Com base nesses fatores foram selecionados três diferentes aldeídos para a síntese dos compostos: piperonal, 3-clorobenzaldeido e anisaldeido.

Seguindo a proposta de rota sintética, o material de partida (2’-hidroxi-4’- metoxiacetofenona) foi obtido através de uma reação clássica de metilação em meio básico utilizando sulfato de dimetila. Apesar de possuir duas hidroxilas livres, houve um alto valor de rendimento final (>99%). O favorecimento da metilação da hidroxila na posição C-4 se deve essencialmente à menor reatividade da hidroxila ligada ao carbono na posição 2’. Esse fato está relacionado à formação de uma ligação de hidrogênio entre o oxigênio da carbonila de cetona e o hidrogênio da hidroxila na posição C-2 (ARJUNAN et al., 2014).

A confirmação da obtenção desse composto, também denominado como paeonol, foi realizada através de técnicas espectroscópicas de RMN de 1H e RMN de 13C. Como se trata de uma estrutura já conhecida, os dados experimentais foram comparados aos relatados pela literatura para elucidação estrutural (ARJUNAN et al., 2014).

No espectro de RMN de 1H o sinal em 12,72 ppm é referente a hidroxila na posição C-2’. Apesar de não ser um sinal característico de hidrogênio desse grupamento químico, seu alto valor de deslocamento químico e formato são justificados pela interação intramolecular com o oxigênio da carbonila (ARJUNAN et al., 2014). Sua presença

demonstra de que de fato não houve metilação nessa posição. Já a inserção da metila na hidroxila em C-4 foi confirmada pelo sinal característico em 3,81 ppm (Espectro 1). Além disso, os valores de integração permitiram confirmar o número total de hidrogênio esperados para a molécula.

Espectro 1: Espectro de RMN de 1_{H (300 MHz, CDCl}

3) da 2’-hidroxi-4’-metoxiacetofenona

O espectro de RMN de 13C corroborou para a confirmação de obtenção do composto desejado, pelo aparecimento de um sinal em 55,5 ppm referente ao carbono do grupo metoxila ligado em C-4 (Espectro 2). Além disso, também foi possível observar o sinal em 202,5 ppm que comprova a presença de uma carbonila característica de uma cetona. Dessa forma, conclui-se que a molécula obtida foi a 2’-hidroxi-4’-metoxiacetofenona.

Espectro 2: Espectro de RMN de 13_{C (75 MHz, CDCl}

3) da 2’-hidroxi-4’-metoxiacetofenona

A princípio, a segunda etapa de reação visando a obtenção de chalconas foi realizada com base na metodologia clássica de condensação de Claisen-Schimdt. Trata-se de uma condensação aldólica, capaz de formar uma ligação entre átomos de carbono, seguida de um processo de desidratação. Apesar de ser amplamente utilizada para a síntese de chalconas, apresenta baixos rendimentos e longo período de reação para a formação do produto final quando hidroxiacetofenonas são utilizadas (MAKRANDI; SURENDER, 2004).

Sendo assim, algumas condições da reação foram alteradas com o objetivo de deslocar o equilíbrio da reação no sentido da formação dos produtos e, consequentemente, aumentar o rendimento final das chalconas. Dentre as condições alteradas, foi utilizado um excesso de cetona, de modo a aumentar a concentração de um dos reagentes além de ser utilizado um tubo secante contendo cloreto de cálcio, visando impedir o excesso de umidade no sistema. Adicionalmente, foi observado uma melhora significativa na velocidade de reação quando a carboximetilcelulose (CMC) foi utilizada. Esse polímero já havia sido relatado na

literatura como um eficiente catalisador em outras reações de condensação aldólica (KARIMI; NAIMI-JAMAL, 2019).

Com o monitoramento por CCD, foi possível observar o surgimento de uma banda de coloração amarela característica da formação de chalconas (Figura 32A). Além disso, também foi possível observar a presença das bandas correspondentes aos materiais de partida que são consumidas lentamente durante a reação de 72h. Após a adição de peróxido de hidrogênio, durante a etapa de formação do flavonol, toda a banda amarela foi consumida. Seu consumo foi acompanhado pelo surgimento de uma banda de coloração roxa e pequeno Rf que se trata supostamente do derivado de flavonoide formado e foi analisada posteriormente (Figura 32B). O perfil cromatográfico da formação de chalcona e derivados de flavonol foi semelhante para a reação partindo dos aldeídos piperonal e 3-cloro-benzaldeido.

Figura 32: Perfil cromatográfico da mistura reacional durante a etapa de formação da chalcona derivada do aldeído piperonal (A) e do 3-cloro-benzaldeido (C) e do flavonol derivado de ambos (B e D, respectivamente).

As bandas 1, 2, 3 e 4 representam: chalcona, cetona, aldeído e flavonoide, respectivamente

A elucidação estrutural do derivado de flavonol partindo do aldeído piperonal (2) também foi realizada através de técnicas espectroscópicas de RMN de 1H e RMN de 13C. Da mesma forma, por se tratar de uma estrutura já relatada, os dados experimentais foram comparados aos relatados na literatura (BORSARI et al., 2019).

O RMN de 1_{H, mesmo não apresentando sinais claros, demonstrou a presença do}

hidrogênio da hidroxila ligada em C-3 em aproximadamente 8,11 ppm. Além disso, foi possível observar também sinais característicos da região de aromáticos (7,69-6,05 ppm) (Espectro 3). Esse conjunto de sinais é característico para esse núcleo (BORSARI et al., 2019). A presença de um simpleto em 6,04 ppm evidencia o CH2 na posição 7’ (anel

dioxano).

Espectro 3: Espectro de RMN de 1_{H (300 MHz, DMSO-d6) do flavonol 1.}

A análise do espectro de RMN de 13C mostrou sinais mais claros e característicos que indicam a presença do flavonol na amostra analisada. Esses sinais também são descritos na literatura entre 172-130 ppm. A presença de um sinal em 55,9 ppm indica a presença do carbono de metoxila na posição C-8 (Espectro 4).

Espectro 4:Espectro de RMN de 13_{C (75 MHz, DMSO-d6) do flavonol 1.}

Visando a obtenção de sinais mais claros, a análise espectroscópica do flavonol 2, derivado do aldeído 3-cloro-benzaldeido foi realizada em equipamento de maior resolução. O espectro de RMN de 1_{H (500 MHz) mostrou sinais com melhor resolução na região}

correspondente à anéis aromáticos, entre 7,88-6,99 ppm, o que indica a formação do núcleo derivado de flavonoide (Espectro 5). Da mesma forma que o composto flavonol 2, é possível observar a presença de outros sinais concentrados especialmente na região hidrogênios aromáticos.

Espectro 5:Espectro de RMN de 1_{H (500 MHz, DMSO-d6) do flavonol 2.}

Um fator inesperado observado com base no RMN de 13C foi a ausência do sinal com deslocamento químico próximo em 56 ppm que indicaria a presença da metila do grupo éter na posição C-8 e o aparecimento dois carbonos carbinólicos em 166,2 e 167,5 ppm (C-3 e C-8) (Espectro 6). Uma das hipóteses seria a desproteção em meio ácido durante o processo de elaboração da reação.

Espectro 6:Espectro de RMN de 13_{C (125 MHz, DMSO-d6) do flavonol 2.}

É importante destacar que os espectros de ambos os compostos previamente purificados por coluna cromatográfica apresentaram uma quantidade de sinais maior que o esperado. Curiosamente, o padrão dos sinais é semelhante nos espectros de RMN de 1_{H dos}

flavonois 1 e 2, indicando a possível presença de uma impureza em comum.

Ao analisar os sinais que não fariam parte da estrutura do flavonol, percebeu-se a similaridade com os dados espectrais do CMC (BAAR et al., 1994). Esse resultado pode ser justificado através da ação da carboximetilcelulose como um catalisador. Durante as reações de condensação aldólicas, é sugerida a realização de uma ligação de hidrogênio com o

composto formado (KARIMI; NAIMI-JAMAL, 2019). Considerando a presença de uma hidroxila livre, além de átomos capazes de realizar também ligações de hidrogênio é possível que o CMC esteja ligado a ambos os compostos mesmo após a purificação por coluna cromatográfica.

Outras metodologias foram então investigadas, tendo como preferência as que permitissem a obtenção da chalcona pura. A síntese desses compostos utilizando hidróxido de bário anidro (C-200) e com ausência no uso de solventes, se destacou por apresentar altos rendimentos relatados com o uso de hidroxiacetofenonas (KUMAR; LAMBAR; MAKRANDI, 2008). Além disso, trata-se de uma metodologia rápida e com o perfil adequado aos princípios da química verde. Para testes foram utilizados o anisaldeido e piperonal como aldeídos e a 2’-hidroxi-4’-metoxiacetofenona.

A primeira chalcona obtida (chalcona 1) foi derivada do anisaldeído e sua formação foi confirmada por meio de RMN de 1H. Seu espectro apresentou sinais na região de aromáticos, dentre os quais Hα e Hβ se encontram na região entre 7,80-7,15 ppm, segundo a

literatura (TESHIMA; TAKEISHI; ARAI, 2009). Outro sinal característico dessa chalcona foi observado em 3,78 ppm e indica a presença da metoxila na posição para derivada do aldeído (Espectro 7).

Espectro 7: Espectro de RMN de 1H (500 MHz, DMSO-d6) da chalcona 1.

De modo semelhante, a segunda chalcona (chalcona 2) sintetizada pela metodologia utilizando grau e pistilo, foi confirmada através da análise de RMN de 1H e comparação dos sinais com os presentes na literatura (BORSARI et al., 2019). Foi possível observar também sinais relacionados aos hidrogênios aromáticos e a presença da dupla ligação com dois dupletos a 7.80 ppm e 7.15 ppm. Além disso, é importante destacar a presença de um simpleto em 6.95 ppm referente ao grupamento metilenodióxido derivado do aldeído utilizado para a síntese desse composto (piperonal).

6 CONCLUSÕES

Com base nas metodologias empregadas e na análise dos resultados, as seguintes conclusões parciais podem ser destacadas.

• Grupamentos polares na região de interação com os sítios M e S se mostraram essenciais para a atividade inibitória em PDE4B. A presença de um anel aromático ou heterocíclico capaz de realizar interações hidrofóbicas com o resíduo de fenilalanina do sítio Q também foi observado como necessário para a atividade;

• Foram determinados dois diferentes e potenciais modos de ligação de BP1 no sítio ativo de ambas as isoformas;

• As isoformas PDE4A e PDE4B demonstraram diferenças significativas em termos de movimentação proteica e explica, em parte, a seletividade de BP1 demonstrada in vitro;

• Baseado nas informações prévias, foi possível propor novos análogos com potencial atividade inibitória em PDE4 e com rota sintética acessível;

• Diferentes metodologias se mostraram eficazes para a síntese de intermediários da rota sintética planejada.

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