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responsável pela seletividade apresentada por um determinado composto seja de difícil elucidação. Vários estudos anteriores utilizaram ensaios experimentais com o objetivo de identificar diferenças estruturais importantes entre as isoformas (FENG et al., 2018; WANG et al., 2007). As razões responsáveis pela seletividade de alguns compostos ainda não foram completamente elucidadas, especialmente quando se baseiam apenas no sítio ativo das enzimas. O uso de metodologias alternativas, como simulações de dinâmica molecular, passou então a ser consideradas uma maneira promissora para a elaboração de novas hipóteses relacionadas ao perfil de seletividade de compostos como BP1.

Um dos parâmetros mais utilizados nas simulações de dinâmica molecular é o root-mean-square deviation (RMSD). O RMSD reflete a média de deslocamento dos átomos de um complexo e seu uso permite determinar uma possível estabilização estrutural em determinado tempo de simulação (MARTÍNEZ, 2015; SARGSYAN; GRAUFFEL; LIM, 2017). Cada um dos possíveis modos de ligação de BP1 no sítio de PDE4A (PDB ID: 2QYK) (WANG et al., 2007) e PDE4B (PDB ID: 3O57) (MITCHELL et al., 2010) foi submetido a uma simulação com menor duração visando a otimização de todos os complexos antes de etapas posteriores. Baseado nessa simulação, o perfil de RMSD de cada modo de ligação do flavonoide em ambas as isoformas demonstrou uma completa otimização antes dos 5.0 ns, sem alterações significativas de conformação durante o tempo. Esse resultado indica que o tempo de simulação foi suficiente para o refinamento das estruturas. (Figura 20).

Figura 20: Gráfico RMSD de todas as simulações de BP1 em PDE4A e PDE4B. Fonte: Dados experimentais.

Os resultados demonstraram que, na maioria das posições de ligação, o flavonoide glicosilado BP1 apresentou valores de energia livre de ligação consideravelmente melhores para a isoforma PDE4B (Tabela 4). Esses valores reforçam a hipótese de que o composto apresentaria interações mais estáveis com o sítio ativo dessa isoforma, corroborando com os resultados dos ensaios in vitro (LOURENÇO et al., 2020).

Tabela 4: Valores calculados por MM/PBSA para cada posição de ligação provávela

Pose ΔEvdw ΔEelec ΔGpolar ΔGSAV ΔGbind

P DE 4 A 1 -51.73 ± 0.34 -8.20 ± 0.21 34.64 ± 0.39 -39.10 ± 0.55 -64.42 ± 0.65 2 -53.73 ± 0.58 0.14 ± 0.35 61.21 ± 2.0 -38.52 ± 1.03 -30.86 ± 2.29 3 -45.93 ± 0.53 -11.52 ± 0.43 63.60 ± 3.52 -39.23 ± 1.19 -32.96 ± 2.59 4 -46.42 ± 0.53 -11.09 ± 0.49 35.08 ± 0.72 -34.59 ± 0.82 -57.07 ± 1.01 5 -41.88 ± 0.15 -7.20 ± 0.14 60.30 ± 0.86 -31.35 ± 0.22 -20.12 ± 0.86 P DE 4 B 1 -65.80 ± 0.44 -25.98 ± 0.43 73.587 ± 0.49 -54.40 ± 0.52 -72.58 ± 0.77 2 -48.77 ± 0.63 -8.23 ± 0.34 37.30 ± 0.41 -35.84 ± 0.84 -55.60 ± 1.19 3 -54.53 ± 0.67 1.18 ± 0.27 51.62 ± 0.70 -40.05 ± 1.02 -41.84 ± 1.41 4 -54.40 ± 0.43 -6.44 ± 0.35 53.79 ± 0.79 -45.27 ± 1.09 -52.27 ± 1.30 5 -56.63 ± 0.22 -21.89 ± 0.25 54.07 ± 0.28 -47.94 ± 0.25 -72.38 ± 0.35

a: Todos os valores, medias e desvio padrão, foram expressos em kcal mol-1

Dentre as posições, a primeira e a quinta se destacaram como possível modo de ocupação para as duas enzimas. A primeira posição de ligação testada, em particular, apresentou melhores resultados de energia livre de ligação em comparação as outras para PDE4A e PDE4B (-64.42 e -72.58 kcal mol-1_{, respectivamente). Já a quinta}

posição testada demonstrou um resultado muito similar ao encontrado para a primeira posição em PDE4B (-72.38 kcal mol-1_{) e por isso também pode ser considerada como}

potencial modo de interação nessa isoforma.

Baseado nos resultados apontados pelo MM/PBSA, as duas posições de ligação mais promissoras foram selecionadas para a análise do comportamento do complexo por um maior período de simulação. O perfil de RMSD das duas diferentes posições, demonstraram novamente uma estabilização completa do complexo antes de 5 ns. Ambas as conformações se mantiveram estáveis após o aumento no tempo de simulação (Figura 21).

Figura 21: Gráfico RMSD das posições de ligação mais promissoras de BP1 em PDE4A e PDE4B Fonte: Dados experimentais

Considerando as características estruturais de PDE4, o primeiro possível modo de ligação apresentou grandes diferenças nas isoformas após o período de simulação. Em PDE4A, o composto demonstrou uma posição estável no sítio Q com uma interação dupla do tipo π-stacking paralela entre os resíduos de aminoácido PHE 296 e PHE 265, além de ligações de hidrogênio com os resíduos HIS 201 e TYR 84. Mesmo com essas interações, houve um deslocamento significativo no sítio de ligação, o que inviabilizou interações com os metais bivalentes do sítio M, consideradas cruciais no processo de inibição (Figura 22A). Contudo, ainda assim, foi considerada a mais promissora, em termos energéticos, em PDE4A a partir dos resultados por MM/PBSA. Seu comportamento durante a simulação pode representar uma hipótese válida capaz de explicar, em partes, a menor capacidade inibitória de BP1 em PDE4A. Já no sítio ativo de PDE4B, o composto também demonstrou alta estabilidade no sítio Q e interações hidrofóbicas do tipo π-stacking paralela com o resíduo PHE 296. Já em relação a ligações de hidrogênio, foi observado um grande aumento em comparação à ocupação em PDE4A. Além disso houve a realização de interações com os metais do sítio M via ligações de hidrogênio com as moléculas de água estruturais (Figura 22B). Esse aumento é confirmado a partir das representações de interações intermoleculares em 2D, que apontou a presença de 8 ligações de hidrogênio no sítio de PDE4B (Figura 22D) em comparação a apenas 2 ligações do mesmo tipo em PDE4A (Figura 22C).

Figura 22: Interações intermoleculares 3D e 2D da primeira pose de BP1, em laranja, e os resíduos de aminoácido de PDE4A (A e C, respectivamente) e PDE4B (B e D, respectivamente).

Fonte: Dados experimentais.

A quinta pose também considerada como promissora demonstrou uma grande diferença entre as energias livres de ligação na enzima PDE4A e PDE4B. De acordo com o resultado apontado pelo MM/PBSA, seria um modo de ligação promissor somente para a isoforma PDE4B. As análises após o período de simulação apontaram apenas pequenas variações quanto às interações hidrofóbicas com os resíduos de fenilalanina presentes no sítio Q. Em PDE4A, o flavonoide BP1 exibiu uma interação do tipo π-stacking paralela com o resíduo PHE 297 (Figura 23A). Já no sítio ativo de PDE4B, BP1 apresentou uma dupla interação também do tipo π-stacking paralela com os aminoácidos PHE 296 e PHE 264 (Figura 23B). Apesar de apresentar um padrão similar de interações hidrofóbicas, os resultados de energia livre de ligação demonstraram uma alta desvantagem dessa posição de ligação no sítio ativo de PDE4A. Analisando as representações em 2D, foi possível observar uma grande diferença entre o número de interações envolvendo os resíduos polares das diferentes isoformas. Em PDE4B, existe um maior número de ligações de hidrogênio em relação a PDE4A

(Figura 23C e 23D), o que contribui para a estabilização do composto no sítio ativo e corrobora com o resultado de MM/PBSA.

Figura 23: Interações intermoleculares 3D e 2D da quinta pose de BP1, em azul, e os resíduos de aminoácido de PDE4A (A e C, respectivamente) e PDE4B (B e D, respectivamente).

Fonte: Dados experimentais.

Visando explicar motivos para a alta diferença de energia livre de ligação e padrões de interação intermolecular, em geral, similares da quinta posição nas duas isorformas, um outro parâmetro de simulação foi analisado. O Root mean square

fluctuations (RMSF) é capaz de mensurar a movimentação de um determinado átomo

ou grupamento presente no complexo proteína-ligante (MARTÍNEZ, 2015). Sendo assim, seu uso teve o propósito de explorar uma potencial influência da flexibilidade proteica na estabilidade do composto no sítio ativo e, consequentemente, na energia livre de ligação total. Nessa análise, a representação em cor vermelha e o aumento da espessura das fitas reflete diretamente o aumento de flexibilidade na região (Figura 24).

Figura 24: RMSF de ambas isoformas, PDE4A (A) e PDE4B (B). Modo de interação da quinta pose em PDE4A (C) e PDE4B (D).

Fonte: Dados experimentais.

Os resultados de RMSF demonstram que existe de fato uma maior movimentação estrutural da isoforma PDE4A em relação à PDE4B (Figura 24A). Uma das movimentações mais significativas envolveu as fitas h14 e h15 próximas ao sítio Q (Figura 24C). A perturbação dessa região possivelmente faz com que as ligações de hidrogênio que envolvem esses aminoácidos se tornem instáveis, causando um aumento significativo na perturbação e movimentação do composto dentro do sítio ativo. Já a mesma região de h14 e h15 em PDE4B provaram ser significativamente mais estáveis, resultando em uma maior quantidade de ligações de hidrogênio (Figura 24B). Pelo aumento da estabilidade estrutural, foi possível observar uma diminuição significativa no movimento de BP1 no sítio ativo da isoforma PDE4B. Esse comportamento resultou em um aumento da interação global com o alvo e pode ser responsável pelos resultados de energia livre de ligação observada para as enzimas testadas (Figura 24D).

Esses resultados indicam que os glicosídeos presentes na estrutura podem ter influência direta na melhoria do perfil de seletividade. A porção glicosídica também

se mostra como responsável por aumentar a capacidade inibitória do composto ao comparar seus resultados in vitro aos já relatados para a quercetina (KO et al., 2004). Sendo assim, trata-se de uma região de grande importância no planejamento de novos potenciais inibidores seletivos baseados no flavonoide BP1.

Adicionalmente, em razão da estabilidade demonstrada, não é possível definir ao certo qual modo de ligação adotado por BP1 no sítio da isoforma PDE4B. Como estudos prévios demonstraram a importância da ocupação do sítio S e sua consequente influência na potência do composto o quinto modo de ligação, com glicosídeos no sítio S, foi considerado para as análises dos análogos de BP1 propostos

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