Nous avons appliqué l’algorithme précédent à des images réelles acquises sur notre montage, dans un premier temps un échantillon test de caractérisation, puis un échantillon biologique.
II.3.1 Billes fluorescentes
L’échantillon test que nous avons considéré est composé de billes fluorescentes de 100 nm de diamètre émettant à une longueur d’onde de 525 nm (FluoSpheres, Molecular Probes). Ces billes sont déposées à la surface d’une lamelle de verre. Elles sont observées avec un objectif 100× à huile, d’ouverture numérique 1,4, et avec un temps d’exposition de 300 ms par image, soit 2,7 s d’exposition totale pour une image reconstruite. La fréquence de modulation est proche de 80% de la fré- quence de coupure du microscope. La figure II.24 permet de comparer une image plein champ classique (A), une image déconvoluée qui en est extraite (B) et l’image super-résolue obtenue avec notre algorithme (C) (après soustraction du fond grâce à l’image de coupe optique et avec ρ = 3 · 10−6). Le gain en résolution apporté par la super-résolution permet de bien distinguer les billes individuelles, ce qui n’était pas le cas sur les images plein champ et de façon bien plus claire que sur les images déconvoluées.
Les TF de ces images montrent bien l’extension du support de l’image comme attendu, avec la forme de rosace classique. La figure II.25 A montre des profils tirés des images présentées qui confirment le gain en résolution apporté par ce traitement. La largeur à mi-hauteur moyenne des billes F W HMmesure a été mesurée avec une
cinquantaine de billes réparties dans l’image. Pour obtenir la largeur à mi-hauteur de la PSF F W HMP SF, il faut la corriger de la taille de la bille F W HMbille par la
formule suivante [44] : F W HMbille = s ln 2 2 dbille (II.20) F W HMP SF = q F W HM2
mesure− F W HMbille2 . (II.21)
Nous avons estimé la largeur de cette PSF pour différentes valeurs du paramètre de régularisation ρ défini précédemment. La figure II.25 B montre la diminition de la largeur effective de la PSF lorsque l’on diminue ce paramètre, car le programme peut plus facilement extraire l’information haute fréquence des images. La largeur à mi- hauteur de la PSF tend vers une valeur de 98±10 nm, pour des valeurs du paramètre
Figure II.24 – Images de billes fluorescentes de 100 nm de diamètre déposées sur une lamelle : A : Image plein champ, B : Image déconvoluée, C : Image SIM (avec coupe optique), D-F : TF des images supérieures.
de régularisation suffisamment faibles (≤ 10−6). Le rapport signal sur bruit des images brutes étant très important (SN R ∼ 130), l’image reconstruite reste peu bruitée et présente peu d’artefacts, même pour des paramètres de régularisation faibles, comme le confirme l’absence de pics dans la TF des images reconstruites. Des rebonds apparaissent néanmoins pour des valeurs très faibles du paramètre de régularisation (≤ 10−6).
La figure II.26 montre les transformées de Fourier d’images plein champ, d’images déconvoluées et d’images SIM obtenues pour deux fréquences de modulation diffé- rentes. Les cercles rouges représentent les limites du support de la TF en prenant en compte le gain en résolution attendu avec l’illumination structurée (1 + fmod/fc).
L’extension spectrale obtenue par reconstruction des images est bien limitée à ce support étendu.
Enfin, nous avons comparé ces largeurs à mi-hauteur mesurées à faible paramètre de régularisation pour différentes fréquences de modulation (et un paramètre de régularisation de 3 · 10−6). Les résultats obtenus sont présentés sur la figure II.27. On voit que la largeur à mi-hauteur de la PSF sur les images SIM diminue avec la fréquence de modulation. On retrouve d’ailleurs le gain attendu de 1 + fmod/fc
entre les images déconvoluées et les images SIM (celles-ci étant intrinsèquement déconvoluées lors de la reconstruction, il est normal que le gain entre les images WF
Figure II.25 – A : Profils de billes extraits des images de la figure II.24 illustrant le gain en résolution apporté par le SIM (ρ = 3 · 10−6). B : Variation de la largeur à mi-hauteur moyenne des PSF plein champ, déconvoluées et SIM pour différentes valeurs du paramètre de régularisation, estimée avec 50 images de billes (les barres verticales montrent l’écart-type associé à la moyenne).
et SIM soit plus important que cela).
Ces résultats montrent donc bien l’efficacité de la reconstruction bayésienne sur un échantillon test, avec notamment des résidus de modulation faibles dans la TF des images super-résolues. On peut également mentionner que l’utilisation d’une estimation contrainte des paramètres de modulation ne génère pas d’artefacts au double de la fréquence de modulation, ce qui signifie que le système optique est capable de générer des motifs d’illumination conformes à ce que nous attendons. Nous allons maintenant voir qu’il en est de même pour des échantillons biologiques.
II.3.2 Disques imaginaux de drosophile
Pour apprécier le gain apporté par la coupe optique associée à la super-résolution, nous avons choisi d’utiliser à nouveau nos échantillons de disques imaginaux de drosophiles. La figure II.28 représente les images plein champ, déconvoluée et SIM avec coupe optique. Ces images sont obtenues avec un objectif 40× ouvert à 0,65, un temps d’exposition de 900 ms par image et une fréquence de modulation de l’ordre de 50% de la fréquence de coupure.
On voit bien que la coupe optique nous permet d’isoler efficacement le signal provenant du plan de mise au point. Des profils des parois cellulaires montrent le gain obtenu au niveau de la largeur à mi-hauteur de ces structures (750 nm sur les images plein champ, 550 nm sur les images déconvoluées et 380 nm sur les images SIM : on retrouve à nouveau un gain de l’ordre de 50 % sur la largeur à mi-hauteur entre les images déconvoluées et les images super-résolues).
Le temps d’exposition important et la faible fréquence de modulation sont princi- palement liés à un signal hors focus très important, qui diminue le rapport signal sur bruit de la modulation. Il serait intéressant d’utiliser des techniques de débruitage
Figure II.26 – Comparaison des TF des images de billes, avec la limite du support de l’OTF effective indiquée en rouge : en haut à gauche : plein champ, en bas à gauche : déconvolution, en haut à droite : image SIM obtenue avec une fréquence de modulation de 68% de la fréquence de coupure, en bas à droite : image SIM avec une modulation de 84% (ρ = 3 · 10−6).
sur les images brutes, ce qui permettrait de diminuer le temps d’exposition et/ou réduire la puissance incidente et/ou augmenter la fréquence de modulation.
Ces deux échantillons nous montrent que la méthode de reconstruction bayé- sienne développée est une alternative intéressante aux algorithmes classiques de reconstruction. Il serait intéressant de comparer les résultats des deux méthodes à partir des mêmes données brutes, mais ne disposant pas d’un algorithme fonctionnel pour la méthode de recalage des spectres, cela n’a pas été possible.
Nous allons à présent nous intéresser à une des conséquences importantes de la reconstruction bayésienne, qui est la possibilité de réduire le nombre d’images nécessaires à la reconstruction, permettant d’espérer une augmentation de cadence de cette technique.
Figure II.27 – Comparaison des largeurs à mi-hauteur des PSF des images plein champ, déconvoluées et SIM, en fonction de la fréquence de modulation (ρ = 3 · 10−6).
Figure II.28 – Disque imaginal de drosophile. A : image plein champ, B : Image déconvoluée, C : Image SIM avec coupe optique (ρ = 5 · 10−3), D-F : TF des images supérieures.