Étoiles artificielles

Intéressons-nous maintenant aux étoiles guides adaptées à notre système. Nous avons besoin de « petites » billes fluorescentes très brillantes absorbant et émettant à des longueurs d’onde différentes de celles de l’échantillon.

La taille maximale des étoiles est principalement imposée par les caractéristiques du Shack-Hartmann, le programme d’analyse des images fournit par celui-ci (déve- loppé par Imagine Optic) doit être capable de séparer les images de l’étoile créées par chaque microlentille de la matrice. Ces différentes images ne doivent donc pas se chevaucher. Beverage et al. [15] proposent un critère simple pour estimer la taille maximum des billes : l’image d’une étoile guide doit être plus petite qu’un dixième de la taille des microlentilles :

détoile ≤ dµ-lentille 10 f3f1eq Gobjfµ-lentillef2 (III.1) avec : détoile le diamètre des billes,

dµ-lentille = 114 µm la taille des microlentilles,

fµ-lentille ∼ 3,5 mm la distance focale des microlentilles,

Gobj = 60 × le grandissement de l’objectif,

f1eq = 381 mm la distance focale équivalente du triplet de lentilles,

f2 = 300 mm la distance focale de la lentille 2,

La distance focale des lentilles du S-H a été déterminée à partir des images qu’il fournit, en considérant que la taille des images d’une bille de 1 µm était limitée par l’ouverture numérique des microlentilles. La formule III.1 s’interpréte simplement : sur la caméra CCD placée derrière la matrice, une zone est allouée à chaque mi- crolentille, dont la surface est égale à la section de cette microlentille. La taille de l’image d’une étoile par une microlentille doit être bien inférieure à la taille du cap- teur correspondant à cette microlentille. On reconnait dans la formule le facteur de grandissement entre l’image intermédiaire du microscope et l’image sur la CCD du S-H f2fµ-lentille

f1eqf3 et G le facteur de grandissement entre l’objet et l’image intermédiaire.

Le facteur 1/10 choisi est peut-être un peu sévère, mais un choix plus approprié nécessiterait de connaître plus précisément le fonctionnement du programme de lo- calisation des images de billes.

On obtient ainsi un diamètre maximum de l’ordre de 5 µm, ce qui laisse beau- coup de marge pour réaliser des particules suffisamment brillantes. Ce critère de taille correspond également à la taille d’une PSF dans l’objet, lorsque l’ouverture numérique limitante est celle du Shack-Hartmann.

Pour avoir un signal important, nous avons choisi d’utiliser des quantum dots comme éléments de base de nos étoiles. Ils sont en général plus brillants et résistants que des fluorophores organiques. De plus, il est possible de choisir leur longueur d’onde d’émission sur une gamme très large (de 500 à 1 000 nm) en jouant sur la taille et la composition des QD, tout en préservant une largeur d’émission étroite (de l’ordre d’une cinquantaine de nm). Enfin le large spectre d’absorption permet de trouver facilement une plage d’excitation à laquelle l’échantillon est insensible. Dans un premier temps, nous avons choisi d’utiliser des quantum dots émettant autour de 620 nm car la synthèse de ces quantum dots est bien maîtrisée et fournit des objets brillants et résistants. De plus, cela permet d’utiliser des échantillons fluorescents jusqu’à 580 nm (l’écart minimum entre la longueur d’onde d’émission des étoiles et celle des marqueurs de l’échantillon dépend des capacités de séparation spectrale du filtre dichroïque. Généralement la largeur de la zone de transition entre la bande reflectrice et transmissive d’un filtre dichroïque est de quelques dizaines de nanomètres), ce qui laisse la possibilité d’utiliser de nombreux fluorophores usuels.

Préparation des étoiles

Les quantum dots seuls ne sont pas suffisamment brillants pour servir d’étoile guide. Pour augmenter le signal, nous avons choisi de les accumuler dans des billes de quelques micromètres de diamètre, facilement dispersables dans l’eau et biocom- patibles. Nous avons opté pour des billes de polystyrène, contenant les quantum dots et stabilisées, en milieu aqueux par des surfactants.

Nous avonc choisi de réaliser nos étoiles artificielles à partir de quantum dots CdSe/CdS/ZnS émettant à 620 nm. La synthèse des billes de polystyrène contenant les QD est décrite en annexe B. Ces billes ont une taille très variable mais certaines sont dans la gamme recherchée et sont suffisamment brillantes pour servir d’étoiles

artificielles pour le Shack-Hartmann. Ces billes en solution dans l’eau sont compa- tibles avec la plupart des échantillons biologiques, et les quantum dots étant très hydrophobes, la diffusion hors du polymère est fortement limitée, ce qui évite une éventuelle toxicité.

Il faut ensuite placer ces billes dans l’échantillon d’intérêt. Dans un premier temps, ces billes sont directement mélangées aux cultures cellulaires lors de la pré- paration de l’échantillon, en espérant trouver des étoiles correctement positionnées pour la correction. La figure III.6 montre une image de cellules dont la tubuline a été marquée, en présence d’étoiles d’une couleur différente. Dans la suite, il sera nécessaire de travailler sur le marquage de l’échantillon par ces étoiles afin de viser les zones d’intérêt et optimiser leur répartition.

Figure III.6 – Exemple d’échantillon de cellules avec la tubuline marquée par l’Alexa 580 et les étoiles artificielles reparties dans l’échantillon.

Maintenant que nous avons les différents éléments nécessaires à la correction d’aberrations, nous allons décrire le protocole d’acquisition d’une image corrigée.