La synthèse des quantum dots CdTeSe/CdZnS utilisés pour la formation des billes à 800 nm est moins robuste et fournit des objets moins brillants que les QD CdSe/CdS/ZnS. La réalisation de billes suffisamment brillantes est donc plus déli- cate. Notamment la synthèse décrite précédemment fournit peu de billes à la fois assez petites et suffisamment brillantes pour réaliser des mesures satisfaisantes de front d’onde (temps d’exposition de 1 à 2 s par front d’onde et moins de 15 mesures possibles avant blanchiment des étoiles). D’autres synthèses de billes ont donc été mise en place.
Nous nous sommes dans un premier temps orientés vers des billes calibrées en taille dans lesquelles sont immobilisés des quantum dots. En jouant sur l’affinité des quantum dots pour les milieux hydrophobes, nous avons voulu faire pénétrer les quantum dots à l’intérieur de billes de polystyrène de 2 µm de diamètre en les gonflant, par un jeu de bons ou mauvais solvants. En pratique, on mélange :
– quelques gouttes de solution aqueuse de billes de taille calibrée (∼ 2 µm) ; – 500 µL de butanol ;
– 50 µL d’une solution de QD dans le chloroforme CHCl3,
et on laisse réagir pendant environ une heure sous agitation. On passe alors les billes dans l’eau par centrifugation forte et redispersion du culot dans de l’eau contenant un surfactant (Igépal CO-520 par exemple).
Cette technique fournit des billes marquées uniquement en surface, avec des concentrations de quantum dots trop faibles pour être utilisables. De plus les par- ticules adsorbées en surface ont une forte tendance à se désorber des billes, ce qui diminue la biocompatibilité.
Nous avons alors cherché à déposer les quantum dots en surface de ces billes de latex de façon plus stable, en utilisant des interactions électrostatiques [1]. À la surface des billes, on dépose successivement :
– une couche de polymères chargés positivement ;
– une couche de quantum dots, entourés de ligands chargés négativement ; – une couche de polymères chargés négativement.
Les polymères utilisés sont l’acide polyacrilique (chargé négativement) et le chlorure de polydiallyldiméthylammonium (chargé positivement), dissous dans un tampon borate à 20 mM, à une concentration d’environ 5 mg/mL. Les billes sont mises en présence des solutions de polymères ou de QD pendant environ 15 min pour s’assurer de l’adsorption des composés. Elles sont ensuite lavées deux fois en les centrifugeant et en les redispersant dans le tampon borate seul avant de déposer la couche suivante.
Les quantum dots sont ainsi solidement adsorbés à la surface des billes, via des interactions électrostatiques. De plus, il est possible de déposer plusieurs couches pour augmenter la charge des billes. Toutefois, après dépot de six couches, ces billes sont tout juste assez brillantes pour une observation prolongée du front d’onde (pas plus de 10 mesures successives à cause du photoblanchiment), ce qui est limitant pour la correction. Pour résoudre ce problème, nous pourrions :
– augmenter la taille des billes, pour augmenter la surface utile (en gardant des billes de diamètre inférieur à ∼ 5 µm pour le Shack-Hartmann) ;
– ajouter un grand nombre de couches de quantum dots, le problème principal étant qu’après un certain nombre de couches, les billes ont tendance à s’agréger en amas de 3, 5, 10 ou plusieurs milliers de billes ;
– marquer les billes en volume.
La dernière solution est réalisable en utilisant des billes de silice mésoporeuse (c’est à dire, contenant des pores de l’ordre d’une dizaine de nanomètres de dia- mètre rendus hydrophobes). D’après Gao and Nie [2, 3], il est possible de charger efficacement ces billes de quantum dots en volume grâce à la large taille des pores. Les premiers résultats sur ces billes sont prometteurs, mais il est nécessaire de véri- fier que les étoiles seront observables suffisamment longtemps afin de déterminer la correction adaptée (entre 10 et 20 mesures de front d’onde successives).
Bibliographie
[1] C. N. Allen, N. Lequeux, C. Chassenieux, G. Tessier, and B. Dubertret. Optical Analysis of Beads Encoded with Quantum Dots Coated with a Cationic Polymer.
Advanced Materials, 19(24), 2007.
[2] X. Gao and S. Nie. Doping Mesoporous Materials with Multicolor Quantum Dots. The Journal of Physical Chemistry B, 107(42), 2003.
[3] X. Gao and S. Nie. Quantum dot-encoded mesoporous beads with high bright- ness and uniformity : rapid readout using flow cytometry. Analytical chemistry, 76(8), 2004.
Les récentes avancées en microscopie de fluorescence (augmentation de résolution spatiale, correction des aberrations induites par l’échantillon...) ouvrent de nombreuses perspectives en imagerie biologique. Mais pour que ces techniques se répandent, il est nécessaire de réduire les contraintes qu’elles imposent sur la préparation des échantillons, sur les sondes fluorescentes, sur la complexité de mise en œuvre ou la cadence d’acquisition. Pendant ma thèse, j’ai travaillé sur le développement et l’amélioration de quelques-unes de ces techniques.
Dans un premier temps, deux systèmes d’illumination structurée ont été réalisés dans le but d’accélérer la cadence de réalisation de coupes optiques pour l’observation d’échantillons épais vivants. Une deuxième partie de mon travail a concerné la mise en place d’une nouvelle approche de reconstruction en illumination structurée afin de dépasser la limite de résolution imposée par le microscope. Cet outil permet de réduire le nombre d’images requises pour la reconstruction d’une image super-résolue, ce qui ouvre la voie à une augmentation de la cadence de réalisation de ces images.
Un montage d’optique adaptative a également été développé afin de corriger les aberra- tions introduites par les échantillons épais, permettant une amélioration des capacités d’ima- gerie en profondeur. L’accent a été mis sur la protection de l’échantillon, grâce à l’utilisation de billes fluorescentes pour déterminer la correction à appliquer sans illuminer l’échantillon. Enfin, un instrument de mesure du rendement quantique de fluorescence dédié à la carac- térisation de fluorophores infrarouges a été mis en œuvre afin de pallier les limitations des méthodes de mesure classiques dans le proche infrarouge.
Abstract
Recent developments in fluorescence microscopy (spatial resolution improvement, sample- induced aberrations correction...) offer many opportunities in biological imaging. But sprea- ding of these techniques will require reduction of the restrictions on sample preparation, fluorescent probes, utilisation complexity, or imaging frame rate. During my Ph.D, I worked on the development and improvement of some of these techniques.
Two structured illumination systems have first been built in order to accelerate optical sectioning realisation in thick samples. A second part of my work focused on the implemen- tation of a new reconstruction approach in structured illumination microscopy to overcome the resolution limit imposed by the diffraction. This tool allows the reduction of the number of images required for reconstruction of a super-resolution image, leading to an increase in imaging speed.
Additionally, an adaptive optics set-up has been developed to correct the sample-induced aberrations, improving imaging abilities in thick samples. The main purpose of this technique is to provide efficient correction, while protecting the sample through the use of independent fluorescent beads for correction estimation. Finally, an instrument for fluorescence quantum yield measurement dedicated to the characterization of infrared fluorophores has been studied to overcome the limitations of conventional methods in the infrared spectral range.