roses parfumées
Dans les deux protéomes de notre étude, plusieurs enzymes de voie de biosynthèse du parfum ont été localisées dans les vésicules lipidiques. Cette localisation est tout à fait compatible avec un stockage ou un transport des COV par les oléosomes. Une étude des COV dans les oléosomes du pétale a donc été réalisée par la technique de flottaison afin de vérifier cette hypothèse. Pour les deux variétés de roses parfumées, la fraction vésiculaire représente une faible quantité de COV, inférieur à 25 ng equivalent camphre/gPF. Après comparaison de la composition des COV contenus dans les vésicules isolées et celle des pétales de roses entiers, une grande perte de parfum (facteur 1000) au moment de l’extraction des vésicules a été observée. Ce résultat montre la difficulté de travailler sur les COV par fractionnement cellulaire et il est possible d’envisager soit que les COV sont cytosoliques et adsorbés par les TG au moment de l’extraction soit que les COV sont dans les oléosomes mais se dispersent dans le tampon lors du broyage.
108 L’adsorption des COV par les TG soulève le problème de leur solubilité lorsqu’ils sont déposés dans le gradient de saccharose. On peut émettre l’hypothèse que plus le COV est lipophile, plus il aurait d’affinité pour un compartiment cellulaire lipidique et donc tendance à diffuser à l’intérieur des vésicules. Les neuf composés présents dans les vésicules sont tous lipophiles, sachant que le 2-phényléthanol est le plus hydrosoluble de tous. Par contre, la réaction au NaDi est positive à la fois in situ et après extraction ainsi ces résultats nous permettraient d’éliminer l’hypothèse de l’adsortion des terpènes par les TG. Même s’il ne s’agit que d’une réaction histochimique, il semble donc que les terpènes soient localisés dans des vésicules des épidermes. Dans ces mêmes épidermes, nous avons démontré que cette réaction colocalise avec la coloration au Nile Red. Nous pouvons donc avancer l’hypothèse que les terpènes seraient soit stockés soit transportés par les oléosomes des épidermes du pétale.
La perte des COV semble donc être l’hypothèse la plus probable pour plusieurs raisons. Une force mécanique puissante est réalisée sur les pétales de rose afin de récupérer les vésicules lipidiques. Elles seraient alors cassées par le fait qu’il n’y aurait plus assez de phospholipides de surface pour les stabiliser. Les COV seraient libérés des vésicules dès la première étape du protocole. De plus, pour la migration des vésicules dans le gradient, une petite quantité de vésicules est diluée dans un milieu aqueux qui lui représente 50 mL et les COV présent dans les vésicules diffuseraient pour s’équilibrer avec le milieu aqueux, ce qui conduirait donc à la perte des COV dans les vésicules. Pour mettre en évidence cette hypothèse, des manipulations de marquage radioactif en utilisant un précurseur radioactif des COV seraient nécessaire. Au cours du temps, un dosage serait effectué dans les vésicules et dans le tampon 0,4 M ce qui permettrait d’évaluer la diffusion des COV. Néanmoins, il n’est pas sûr qu’une telle technique donne des résultats exploitables à cause de la vitesse de diffusion des COV dans le milieu et les difficultés inhérentes aux dosages radioactifs.
De plus, avec la technique de fractionnement cellulaire utilisée, la fraction vésiculaire récupérée ne représenteraient peut être pas la totalité des vésicules présentes dans les pétales frais. Il aurait été intéressant d’estimer le rendement d’extraction des vésicules. Cet argument permettrait d’expliquer la faible quantité de COV dans les vésicules et par conséquent la concentration de COV dans la fraction 0,4 M.
Une dernière hypothèse peut être avancée qui exclurait l’adsorption et la perte des COV. La différence de quantité de COV entre la fraction vésiculaire et la fraction 0,4 M représenterait une réalité biologique. Il existerait d’autres mécanismes de transport des COV que celui de la
109 sécrétion granulocrine et ces vésicules seraient soit l’un des nombreux sites de stockage des COV, soit seraient un compartiment de transport entre une zone de production et une zone de stockage.
La composition en COV des deux variétés de roses étudiées après fractionnement cellulaire a permis de montrer que seule la rose ‘Grégory Lemarchal’ posséde du 2-phényléthanol dans les vésicules lipidiques alors que ce composé est présent dans les pétales de rose des deux variétés. L’absence de ce COV dans les vésicules de ‘Caprice de Meilland’ est peut être due a une grande perte de parfum (facteur 1000) au moment de l’extraction des vésicules et de plus ce composé est en très faible quantité dans les pétales entier (2,2.103 ng équivalent camphre/gPF), ainsi sa détection n’a pas été possible dans ce compartiment cellulaire. Il serait intéressant de vérifier et confirmer la présence de ce 2-phényléthanol dans les vésicules lipidiques. Comme ces composés aromatiques ne peuvent pas être visualisés en microscopie car il n’existe pas de produits spécifiques permettant de les mettre en évidence, la technique de flottaison serait utilisée sur trois autres variétés de roses renfermant une grande quantité de 2-phényléthanol dans les pétales. Ainsi, on pourrait confirmer la présence ou l’absence de ce composé dans les vésicules lipidiques de rose.
Une perspective prometteuse pour la suite de ce travail est fournie par un article d’imagerie des huiles essentielles in situ (Strehle et al., 2005). Dans cet article, les auteurs localisent des phospholipides dans des vésicules de graine de fenouil (Foeniculum sp.). Ils localisent aussi de l’anethole (un phénylpropanoïde) dans d’autres vésicules. La technique utilisée est nommée « Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Spectroscopy ». Il s’agit d’une technique d’imagerie permettant d’augmenter et d’imager certaines longueurs d’ondes (dites Raman) émisent par une molécule frappée par des photons. Nous envisageons de colocaliser une molécule du parfum et les TG.
En conclusion de cette partie, l’étude des mécanismes d’émission du parfum des roses a été appréhendée par différentes techniques. Nous avons mis en évidence, dans les pétales de roses, des vésicules lipidiques s’apparentant à des oléosomes. Elles ont la caractéristique de posséder une matrice centrale où se concentrent les TG entourés vraisemblablement d’une membrane à un seul feuillet phospholipidique. Mais il semblerait qu’elles soient dépourvues d’oléosine. Ces oléosomes contiennent des enzymes de voies de biosynthèse. Grâce au protéome effectué sur les oléosomes, nous avons mis en évidence qu’ils renferment de nombreuses protéines notamment des protéines de stress, du protéasome ou encore des
110 protéines du cytosquelette. Des hypothèses sur le rôle des oléosomes peuvent être avancées selon lesquelles les vésicules seraient un site de séquestration pour certaines protéines soit dans le but de les inactiver soit pour éviter des agrégats protéiques qui causeraient des dommages cellulaires. Nous avons ensuite montré que les COV sont stockés dans les vésicules. Cependant ce point reste encore flou et d’autres études sont nécessaires pour pouvoir confirmer le rôle des vésicules dans le stockage des COV.
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Etude de la biosynthèse du
2-phényléthanol par une
approche génétique : résultats
I. Corrélation entre la production et l’émission
du 2-phényléthanol
Dans cette partie, nous cherchons à étudier l’expression des allèles du gène RhPAAS (Kaminaga et al., 2006) dans une population issue d’un croisement entre une rose productrice de 2-phényléthanol, R. wichuraiana, et une rose très faiblement productrice, R. x hybrida ‘H190’. Des résultats préliminaires ont en effet montré qu’il existait un QTL majeur expliquant la présence ou l’absence de 2-phényléthanol dans cette population HW et que le gène RhPAAS était situé à côté de ce QTL (Figure 5). Dans un premier temps, nous avons donc cherché à bien définir les stades de prélèvement et à bien connaître les variations en 2-phényléthanol. Dans un second temps, nous avons étudié l’expression des allèles a1, a2 et a3.