2-phényléthanol
Chez les roses parfumées, des petites différences entre la production et l’émission des COV ont été notées. Cependant une corrélation existe entre ce qui est à l’intérieur des différents organes floraux et ce qui est émis par la fleur au stade FE. Certains COV sont présents dans les tissus de la fleur mais ne sont pas émis au stade FE. Plusieurs explications peuvent être proposées. Les faibles quantités de ces COV, inférieurs à 5 %, stockés à l’intérieur des tissus floraux, sont peut être émis en trop faible quantité pour être détectés. De plus, la capture des COV émis reste une technique difficile car ils sont sous l’influence des conditions extérieures. Par exemple, si la température ambiante est élevée, les COV seront émis rapidement. Pour que les variations dues au rythme d’émission des COV et aux conditions environnementales ne perturbent pas l’expérimentation, il faut faire des analyses à des intervalles de temps rapprochés. Une autre hypothèse peut être avancée selon laquelle ces composés seraient émis en décalage par rapport à leur biosynthèse. Des études des rythmes d’émission des COV montrent qu’ils peuvent être spécifiques pour un composé. Par exemple, chez Rosa x hybrida ‘Honesty’, la dihydro-β-ionone a un rythme d’émission particulier (Helsper et al., 1998).
R. wichuraiana émet une quantité importante de 2-phényléthanol ce qui est en accord avec les analyses d’extraction des COV dans les pétales de rose. Tandis que R. x hybrida ‘H190’ en émet une quantité négligeable ce qui reste en accord avec sa faible production. Nous avons donc utilisé l’extraction sur pétales des fleurs au stade FE pour la suite de notre travail.
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II. Corrélation entre l’expression du gène RhPAAS
au stade BJO et la production de 2-phényléthanol
au stade FE
Dans la suite de notre étude, nous avons cherché à corréler la production du 2-phényléthanol à l’expression du gène RhPAAS.
Au stade FE, une corrélation entre l’expression du gène RhPAAS et la production de 2-phényléthanol a été observée chez les parents mais pas chez les descendants (population HW). Chez les parents, seul R. wichuraiana, présente à la fois une forte expression de RhPAAS et une grande quantité de 2-phényléthanol. Dans la population HW, les descendants avec ou sans expression de RhPAAS peuvent présenter beaucoup ou peu de 2-phényléthanol.
A la vue de ces résultats surprenants, nous nous sommes interrogés sur le profil d’expression du gène RhPAAS au cours du développement floral. Pour les deux parents, le niveau maximal d’expression de RhPAAS, amplifié avec les amorces internes, est atteint au stade BJO avec une très forte expression pour R. wichuraiana. Avec les amorces UTR, beacoup plus spécifiques, l’expression de RhPAAS n’est observée qu’au stade BJO de R. wichuraiana. De plus, dans la population HW, lorsque l’ADNc est amplifié avec les amorces UTR, seuls les descendants produisant une quantité importante de 2-phényléthanol expriment le gène RhPAAS. Le même phénomène est observé chez R. x hybrida ‘Fragrant Cloud’ où le transcrit est accumulé au stade BJO dans les pétales c’est-à-dire avant le maximum d’émission du parfum (Farhi et al., 2010). Il y a donc un décalage entre l’expression du gène RhPAAS et la production de 2-phényléthanol. Le 2-phényléthanol serait produit au stade BJO et pourrait être stocké pour être ensuite émis au stade FE. Selon certains auteurs, les parfums seraient déjà présents sous une forme glycosylée non volatile dans les pétales dès les stades précoces de développement (Ackerman et al., 1989 ; Riou et al., 1998 ; Reuveni et al., 1999 ; Jakobsen et Christensen, 2002 ; Hayashi et al., 2004). Ainsi, chez le narcisse, l’augmentation de la production des COV est liée à l’augmentation de l’activité β-glucosidase (Reuveni et al., 1999). Chez R. x damascena, la quantité de 2-phényléthanol glycosylé, produit dans les stades précoces, diminue au cours du développement floral alors que l’activité de la β-glucosidase augmente, parallèlement à l’augmentation de la quantité de 2-phényléthanol (Watanabe et al., 2002). Ainsi, ces formes conjuguées pourraient avoir un rôle de stockage des COV. Dans notre étude, une analyse du 2-phényléthanol glycosylé et sa forme volatile au cours du développement floral de la rose serait intéressante.
132 De plus, cette expérience permet de mettre en évidence que les deux couples d’amorces, internes et UTR, n’amplifient pas les mêmes allèles. L’ADNc de RhPAAS aux stades BJO et FE, amplifié avec les amorces internes, montre qu’il n’y a aucune corrélation entre l’expression du gène et la production de 2-phényléthanol. En effet, les descendants qui produisent une faible ou une importante quantité de 2-phényléthanol, expriment toujours le gène RhPAAS avec une intensité plus ou moins forte. Il semblerait que ces couples d’amorces internes amplifient un mélange d’allèles tandis que les amorces UTR amplifieraient qu’un seul allèle de RhPAAS car seuls les descendants produisant une grande quantité de 2-phényléthanol l’exprime.
III. Corrélation entre l’allèle a1 et la production de
2-phényléthanol
Trois allèles différents ont été séquencés chez R. wichuraiana et R. x hybrida ‘H190’. Nos résultats semblent indiquer que la variété R. wichuraiana possède deux allèles et présente un génotype a1/a2. Ce résultat est corrélé avec le génotype de R. wichuraiana obtenu en SSCP où il a été mis en évidence que le parent mâle possède deux allèles différents. Pour R. x hybrida ‘H190’, un seul allèle noté a3 est observé. R. x hybrida ‘H190’, il présenterait un génotype a3/a3 ce qui est également en accord avec les données récupérées grâce à la technique SSCP (Annexe 1) pour laquelles le parent femelle possède un seul allèle. De plus, ceci confirme les données connues sur ces rosiers où la variété R. wichuraiana est un rosier diploïde et R. x hybrida ‘H190’ un rosier dihaploïde.
Ensuite, nous nous sommes intéréssés à l’expression de ces allèles chez les parents et la descendance et nous avons cherché à comprendre les résultats de chaque allèle (Figure 38). Il semblerait que l’allèle a1 soit lié à la production du 2-phényléthanol. Il ne s’exprime que chez les variétés de roses produisant une grande quantité de 2-phényléthanol comme R. wichuraiana et les descendants 24, 306, 376, 530. Ce phénomène est décrit pour la première fois.
L’allèle a2 s’exprime uniquement chez les roses produisant très peu de 2-phényléthanol. L’allèle a2 pourrait donc coder pour une protéine peu ou pas fonctionnelle. En comparant les séquences protéiques a1 et a2, seulement deux acides aminés sont différents et ils ne sont pas localisés au niveau du site catalytique. Il y a donc de faible chance pour que le changement de ces deux acides aminés modifie la structure tridimensionnelle de la protéine a2. Pour
133 expliquer que ces roses produisent très peu de 2-phényléthanol, il faudrait peut être s’intéresser aux régulations transcriptionnelles.
A l’état homozygote, chez R. x hybrida ’H190‘, l’allèle a3 s’exprime, il est corrélé à la présence d’une petite quantité de 2-phényléthanol. Lui-aussi pourrait donc donner une protéine peu ou pas fonctionnelle. Par contre, à l’état hétérozygote, donc dans la population HW, il n’est jamais séquencé donc probablement peu ou pas exprimé. Cette hypothèse est corrélée avec l’absence d’amplification en RT-PCR chez R. x hybrida ‘H190’, lorsque l’on utilise les amorçes internes soupçonnées d’amplifier plusieurs allèles.
Ce travail complète celui de Spiller et al. (2010), dans lequel deux QTL, différents du nôtre, mais semblant expliquer des variations de quantité de 2-phényléthanol ont été cartographiés dans une population issue d’un croisement entre R. multiflora et un génotype non déterminé. L’un, est proche du gène RhAADC cloné par Sakai et al. (2007) et l’autre, du gène RhAAT1 cloné par Guterman et al. (2002). Cependant, aucune étude de cause à effet n’a été entreprise dans ce travail. Dans notre cas, nous expliquons la présence de 2-phényléthanol par l’expression de l’allèle a1 du gène RhPAAS.
134 a1 Descendants a2 RW a3 a3 a1 a3 + -H190 X a1 a3 Descendants a1 + a2 a3 a2 -a3 a3 H190 a1 a2 RW
Mâle Femelle Mâle Femelle
Figure 38 : schéma récapitulatif de l’expression des différents allèles exprimés chez les parents et les descendants. – représente les individus produisant peu de 2-phényléthanol et + correspond aux individus produisant beaucoup de 2-phényléthanol.
En conclusion de cette partie, nous avons trouvés tout d’abord les conditions pour lesquelles la quantité de 2-phényléthanol est maximale. Il s’agit des pétales au stade FE. Cependant, les résultats en PCR semi-quantitatives au stade FE ne se sont pas révélés concluantes. Ce n’est qu’au stade BJO avec les amorces UTR que la corrélation entre l’expression du gène RhPAAS et la production de 2-phényléthanol a été mise en évidence. Le 2-phényléthanol pourrait être produit sous forme glycosylée, non-volatile, au stade BJO et être émis au stade FE. Pour la première fois, nous avons mis en évidence que l’allèle a1 est lié à la production de 2-phényléthanol tandis que l’allèle a2 s’exprime uniquement chez les roses produisant très peu de 2-phényléthanol.
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