Pour l’analyse protéomique, 500 g de pétales ont été traités selon le protocole de fractionnement cellulaire mis au point précédemment. Pour faciliter la récupération de la fraction lipidique vésiculaire, le tampon 0,2 M du gradient a été supprimé. Après avoir extrait et mis en suspension les protéines, un gel d’électrophorèse en 1D de type SDS-PAGE a été réalisé pour séparer, en fonction de leur masse, les différentes protéines qui composent les vésicules, puis coloré à l’Instantblue (Figure 24).
86 11 17 26 34 43 55 72 95 130 170 kDa
Figure 24 : séparation des protéines de la fraction vésiculaire de pétales de R. x hybrida ‘The Mac Cartney Rose’ par électrophorèse de type Nupage coloré à l’Instanblue. Les protéines sont déposées dans 5 puits à cause du volume important de l’extrait. L’expérience est réalisée deux fois. L’échelle de poids moléculaire PageRuler (Fermentas), 5 µL.
Des bandes correspondantes à des protéines vésiculaires de tailles variables allant de 15 à 95 KDa sont observées. Les bandes correspondant à des tailles inférieures à 15 KDa et supérieures à 95 KDa ne sont pas prises en compte dans notre étude car leur intensité est trop faible pour être ensuite détectées par chromatographie en phase liquide. Les protéines de différents poids moléculaires ont été récupérées et analysées par chromatographie en phase liquide avec ionisation par electrospray couplé au spectre de masse (LC-nano ESI-MS/MS) par le Centre Commun de Microséquencage des Proteines (CCMP, IFR 128, IBCP, Lyon). Les résultats d’identification des protéines des vésicules de pétales de R. x hybrida ‘The Mac Cartney Rose’ sont présentés dans le tableau ci-dessous (Tableau 15).
87 Tableau 15 : résultats des protéines séquencées. X : protéine trouvée une seule fois dans les deux protéomes. XX : protéine trouvée dans les deux protéomes réalisés. Le score généré par l’algorithme Paragon du logiciel Protein Pilot permet de hiérarchiser les résultats obtenus en fonction de la précision de mesure, du nombre de peptides matchés et la couverture de séquences. Un score de 2 correspond à 99 % de certitude. VL : vésicules lipidiques animales ou fongiques.
Noms de protéines Répétition Score Groupes fonctionnels Localisation dans des vésicules
Lipoxygénase X 2,5
Synthèse du parfum
Oléosomes
O-méthyltransférase XX 9
Caroténoïde dioxygénase XX 14 Plastoglobules
HSP70 XX 10 Stress VL HSC70 XX 9,43 VL HSP90 XX 4 VL BiP XX 6,4 VL HSP81 XX 4 HSP101 X 3,2 2-cysteine péroxiredoxine X 3,2 Protéine 14-3-3 XX 3 Superoxide dismutase X 8
GRP ARN X 15,1 Stress/synthèse des protéines
Ubiquitine XX 4,4 Stress/protéasome/protéolyse Polyubiquitine X 5,25 26S protéase X 6 Stress/protéasome CDC48 X 3,2 Chaperone DnaK X 5,6 Stress/protéolyse Chaperone Clp X 6,4 Complexe protéase Clp X 3,3 Fibrillines XX 4 Protéine de structure Plastoglobules Tubuline XX 4 VL Actine XX 8,7 VL
H+-ATPase membrane plasmique X 10 Pompe à proton Oléosomes
Facteur de ribosylation ADP
(=ARF) X 6,4 Transduction du signal VL
Catalase X 2 Photosynthèse VL
Phospholipase D X 7 Métabolisme des lipides VL
Isocitrate déshydrogénase X 4 Cycle de Krebs Malate déshydrogénase XX 5 Aconitase X 4 GAPDH XX 16 Glycolyse 3-phosphoglycerate kinase XX 2,48 Pyruvate kinase X 4
Fructose bisphosphate aldolase XX 9 Phosphoglucose isomérase X 2,3
Enolase XX 13
IPGAM X 3,5
88
Noms de protéines Répétition Score Groupes fonctionnels Localisation dans des vésicules
Pyruvate décarboxylase X 4
6-phosphogluconate
déshydrogénase XX 3 Voie des pentoses phosphate
Transcétolase X 8
Serine hydroxyméthyltransferase X 6
Métabolisme des acides aminés Aspartate kinase II / complexe
homoserine déshydrogénase X 3,2
IPGAM X 3,5
Adénosylhomocystéinase XX 12 S-adénosylméthionine synthétase XX 7,1 Met synthase VitB12 independent XX 10
Ribosome 40S XX 8,4
Synthèse protéique
Ribosome 60S X 9,6
Facteur d'initiation de traduction X 7,2 Facteur d’élongation XX 7
Cyclophiline XX 2
Phosphoglucomutase XX 6
Métabolisme des sucres et de l’amidon UDP-glucose déshydrogénase X 4,4 Invertase XX 2 α-xylosidase X 2,3 UDP-glucose pyrophosphorylase X 13 Saccharose synthase XX 3,5
Les protéines identifiées sont réparties par groupes fonctionnels incluant notamment les protéines impliquées dans le métabolisme primaire, dans la voie de biosynthèse des parfums, dans le stress et dans le protéasome. Il est à noter que certaines protéines sont communes à deux groupes de fonctions différents.
Les protéines du métabolisme primaire comprennent les protéines du cycle de Krebs, de la glycolyse, de la voie des pentoses phosphate, du métabolisme des acides aminés, de la synthèse protéique et du métabolisme des sucres et de l’amidon. Elles ont été trouvées en grand nombre (46 %). Beaucoup de ces protéines sont cytosoliques et proviennent vraisemblablement d’une contamination lors de la préparation des vésicules lipidiques ; leur présence n’a jamais été démontrée dans les oléosomes. Par exemple, la D-fructose-1,6-biphosphate aldolase, des invertases et des saccharoses synthases ont été identifiées dans notre protéome. Dans d’autres travaux, la D-fructose-1,6-biphosphate aldolase, isolée de l’épinard, du pois, du blé et de la fraise, a été observée dans deux compartiments cellulaires, le cytosol et les chloroplastes (Lebherz et al., 1984 ; Anderson et Pacold 1972 ; Gasperini et Pupillo ; 1983 ; Schwab et al., 2001), jamais dans des oléosomes. La même recherche bibliographique peut-être faite pour les invertases. Elles interviennent dans le métabolisme des sucres pour
89 hydrolyser le saccharose en glucose et fructose. Chez les plantes, il existe trois types d’invertases : deux fonctionnent à pH acide (=5) et sont localisées dans la vacuole et la paroi, la troisième fonctionne à pH alcalin (=7,5) et est localisée dans le cytosol. Cependant les invertases ne sont pas les seules enzymes à dégrader le saccharose. La saccharose synthase, soluble ou membranaire, hydrolyse le saccharose en fructose et UDP-glucose de façon réversible (Roistch et Gonzàlez, 2004). Chez les plantes, l’ensemble des réactions enzymatiques de la glycolyse se déroule à la fois dans le cytoplasme et dans les plastes (Plaxton, 1996). Par exemple, la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogenase (GAPDH) est une enzyme cytosolique et plastidiale qui convertit de façon réversible la glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-biphophoglycérate. Elle joue un rôle également dans la gluconéogenèse (Plaxton, 1996). Chez les plantes, le glucose et le fructose sont rapidement phosphorylés en glucose-6-phosphate et en fructose-6-phosphate pour rentrer dans la glycolyse et dans la voie des pentoses phosphates. Cette dernière a lieu dans le cytosol. Elle est principalement responsable de la synthèse de NADPH à partir de NADP+. Elle démarre avec l’oxydation du glucose-6-phosphate pour produire du ribulose-5-P. C’est la seule voie de dégradation des hexoses qui permet la réduction du NADP+. Elle produit également l’érythrose-4-phosphate qui est utilisé dans la voie de l’acide shikimique, le ribulose-5-phosphate pour la synthèse de l’isopentényl pyrophosphate (IPP) et des composés de la paroi cellulaire et le ribose-5-phosphate, précurseur des nucléotides (Taiz et Zeiger, 1998; Bramley, 1997). Le cycle de Krebs ou cycle des acides tricarboxyliques, responsable de la dégradation du pyruvate, se déroule dans la matrice ou au niveau de la membrane interne de la mitochondrie. Par exemple, l’isocitrate déshydrogénase est localisée dans la matrice mitochondriale (Galvez et al., 1998). Comme on le voit, pas une seule de ces voies métaboliques et pas une des enzymes liées à ces voies n’a jamais été localisée dans des oléosomes. De plus, il n’existe aucune hypothèse bibliographique permettant de supposer que des étapes de la glycolyse, de la gluconéogenèse ou des voies que nous venons de décrire se déroulent sur ou dans les oléosomes. La conclusion est donc qu’il s’agit de protéines contaminantes.
Treize % des protéines de nos protéomes ont déjà été localisées dans les corps lipidiques des animaux ou des levures. Parmi ces protéines, certaines sont des protéines de structures comme la tubuline et l’actine, d’autres sont des protéines liées au stress, notamment HSP70 et la BiP qui sont des chaperonnes. Des pompes H+-ATPase de la membrane plasmique ont déjà été identifiées dans les vésicules lipidiques des pétales d’œillet (Hudak et Thompson, 2000). L’ARF ou « ADP ribosylation factor », protéine faisant partie de la famille des protéines G,
90 est commune à notre protéome et à celui des animaux. En effet, chez les souris, l’ARF-GFP a été détecté en microscopie confocale à la surface des corps lipidiques. Pour confirmer cette présence dans ce compartiment, une colocalisation entre l’ARF et la protéine marqueur des adipocytes a été mis en évidence (Nakamura et al., 2005). La catalase a également été identifiée et elle est retrouvée dans les corps lipidiques des levures. Elle a un rôle de catalyser la dismutation de l’eau oxygénée (Veenhuis et al., 1989). La phospholipase D dans les vésicules lipidiques des pétales de rose est commune à celle des animaux. Chez la souris, en « Western-blot », la phospholipase D a été mise en évidence dans la fraction vésiculaire. Sa localisation a été confirmée en microscopie confocale (Nakamura et al., 2005).
Deux % des protéines sont liées au COV dont trois enzymes des voies de biosynthèse du parfum retrouvées dans ces deux protéomes. La caroténoïde dioxygénase produisant de la β-ionone a déjà été montrée dans les plastoglobules (Rubio et al., 2008), la lipoxygénase donnant des dérivés des acides gras odorants, déjà observée, en microscopie, dans les oléosomes (Radetzky et al., 1993) et l’O-méthyltransférase, la présence de cette dernière n’ayant jamais été démontrée dans les corps lipidiques (Scalliett et al., 2006).
Une autre protéine très intéressante, la fibrilline, a été mise en évidence et marque spécifiquement les plastoglobules. Cependant, la protéine marqueur des oléosomes, l’oléosine, n’est pas été trouvée dans ces deux protéomes.
En conclusion, l’analyse protéomique a montré que la fraction lipidique vésiculaire des pétales de rose contient des protéines déjà observées dans d’autres protéomes de vésicules lipidiques (vésicules lipidiques animales ou fongiques, oléosomes et plastoglobules). Certaines de ces protéines ont été localisées par GFP ou immunocytochimie sur des vésicules lipidiques (Tableau 15). Celles qui nous intéressent le plus sont bien sûr les enzymes de biosynthèse de COV. Cependant, concernant les protéines marqueurs de cet organite, seule la fibrilline strictement associée aux plastoglobules a pu être identifiée.