4.4.3.1 Recherche de plates-formes fondée sur la similarité des structures secondaires

al. et concernent le transfert de sites de liaison fonctionnels de lymphocyte humain CD4 sur une petite plate-forme naturelle en vue d'inhiber la liaison de la glycoprotéine gp120 de l'enveloppe du virus HIV-1 au CD4 (Drakopoulou et al., 1998). Le site de liaison du CD4 à la gp120 a été

localisé au niveau de la boucle similaire au CDR2. Un mime de CD4 (CD4M possédant 33 acides aminés) a donc été conçu par transfert des résidus de la boucle similaire au CDR2 sur une boucle de structure équivalente d'une plate-forme possédant trois ponts disulfures, la toxine de scorpion charybdotoxine caractérisée par une structure en "/!! (Figure I.11). Cette plate- forme CD4M est capable d'inhiber de façon spécifique la liaison du CD4 à la gp120 mais néanmoins avec une faible affinité (IC50 de 20 µM) comparée à celle du CD4 (IC50 de 0,8 nM).

Figure I.11 : Comparaison entre le CD4 et la plate-forme mime. A et B : Structures 3D du domaine D1 du hCD4 (Code PDB 1CD4) et de la plate-forme structurale charybdotoxine (Code PDB 2CRD). Les protéines sont représentées en mode cartoon et la structure secondaire (2 feuillets ! antiparallèles) portant le motif fonctionnel d’intérêt est coloriée en rose. C : Séquences du motif fonctionnel d’intérêt (CDR2) du hCD4, de la plate-forme charybdotoxine et de la plate-forme charybdotoxine modifiée

CD4M (résidus modifés en rouge) (Drakopoulou et al., 1998).

Des travaux ultérieurs réalisés par le même groupe sur une plate-forme similaire à la charybdotoxine, la scyllatoxine, ont permis de concevoir une deuxième mini-protéine, le CD4M3 (27 acides aminés) par transfert de 9 résidus de CD4 (Figure 1.12 ; Vita et al., 1999). Cette nouvelle plate-forme inhibe la liaison du CD4 à la gp120 avec un IC50 qui est encore au moins 25 fois supérieur à celui de la CD4 native (IC50 de 20 à 350 µM en fonction de la souche virale exprimant les gp120 recombinantes). L'analyse structurale et fonctionnelle réalisée a permis d'identifier cinq mutations supplémentaires qui, une fois réalisées dans la plate-forme, ont conduit à une augmentation de l'affinité pour la gp120 de 40 à 400 fois en fonction de la souche virale (IC50 de 0,1 à 1 µM). Ce mutant CD4M9 inhibe l'infection des

cellules CD4+ par différentes souches virales HIV-1 confirmant l'activité antivirale large spectre de cette plate-forme. Après plusieurs étapes d'optimisation, un nouveau mime de CD4 a été obtenu (Martin et al., 2003). Ce mutant appelé CD4M33 inhibe la liaison du CD4 à deux différents isolats de gp120 avec une affinité similaire au CD4 recombinant (IC50 de 7,5 nM et 4 nM) et bloque l'entrée et l'infection des cellules immunitaires par les souches HIV-1 in vitro.

Figure I.12 : Structures 3D et séquences de la plate-forme Scyllatoxine et ses variants. Les protéines sont représentées en mode cartoon. A : Structures 3D de la plate-forme Scyllatoxine (Code PDB 1SCY) en orange, avec la structure secondaire (2 feuillets

! antiparallèles) sur laquelle est transféré le motif fonctionnel d’intérêt coloriée en rose. B : Structure 3D d’un modèle de complexe CD4M9 (jaune)/gp120 (vert) avec les résidus essentiels dans l’interaction représentés en bâtons bleu (CD4M9) et

rouge (gp120). C : Séquences de la plate-forme Scyllatoxine ainsi que ses variants CD4M9, CD4M32 et CD4M33. Chaque mutation par rapport à la protéine précédente est indiquée en rouge. Ac : groupement acétyl N-terminal ; Tpa : Acide

thiopropionique ; Bip : Biphénylalanine. (Martin et al., 2003).

Les charpentes en "/!! des toxines de scorpion, caractérisées par une hélice " N- terminale à trois pas reliée par trois ponts disulfures à deux feuillets ! en épingle à cheveux, ont été utilisées dans d'autres travaux de conception de plates-formes par mimétisme d'épitopes naturels du fait de leur conformation particulièrement stable. Alors que le groupe de Vita et al. a exploité le motif en feuillets ! de ces toxines de scorpion, le groupe de Li et al. a exploité le segment en hélice " d'une toxine de scorpion appelée BmBKTx1 (Li et al., 2008). Ce travail décrit la conception d’un mime de la protéine p53 suppresseur de tumeurs afin de bloquer son

interaction avec les protéines oncogènes MDM2 et MDMX qui en régulent négativement l'activité et la stabilité, et dont la surexpression dans plusieurs tumeurs conduit à l'inactivation de p53 et à la survie des tumeurs. La liaison de ces protéines avec p53 se fait au niveau du motif hélicoïdal de séquence T18F19S20D21L22W23K24L25L26. En particulier, lors de la liaison au

domaine N-terminal de MDM2 ou MDMX, p53 adopte une structure en hélice " où les résidus F19, W23 et L26 de p53 s'insèrent dans une cavité hydrophobe des protéines oncogènes. Les

résidus considérés comme « hot spots » F19, L22, W23 et L26 ont donc été replacés au niveau des

positions topologiquement équivalentes sur la plate-forme BmBKTx1, une protéine synthétique de 31 résidus adoptant une structure hélicoïdale partielle au niveau de la région d’intérêt (Figure I.13).

Figure I.13 : Comparaison des structures 3D du domaine de p53 et de la plate-forme BmBKTx1. A gauche : Complexe de MDM2 représenté en mode surface en gris avec le domaine de transactivation de p53 représenté en mode cartoon en rose avec les résidus essentiels à la liaison à MDM2 représentés en mode bâtons et annotés (Code PDB 1YCR). A droite : Structure 3D de

la plate-forme BmBKTx1 caractérisée par une hélice " similaire à celle portant le motif d’intérêt dans p53 (Code PDB 1R1G).

Le peptide résultant nommé stoppin-1 adopte également en solution aqueuse une conformation " hélicoïdale partielle identique à celle de BmBKTx1. Des études basées sur les spectres de dichroïsme circulaire montrent que stoppin-1 se lie à des domaines synthétiques de MDM2 (synMDM2) et MDMX (synMDMX) impliqués dans la liaison à p53, de manière similaire à p53, par enfouissement du résidu Trp23 dans les cavités hydrophobes de MDM2 et MDMX. L’affinité de stoppin-1 pour synMDM2 et synMDMX (Kd de 790 nM et 994 nM respectivement) est seulement 6 à 3 fois plus faible que celle de p53 pour ces mêmes ligands

(Kd de 123 nM et 279 nM respectivement), tandis BmBKTx1 n’a aucune affinité pour ces ligands. Ces résultats valident donc l’approche de transfert de résidus qui a permis de concevoir un inhibiteur compétitif des interactions p53-MDM2/MDMX. En revanche, il a été démontré que stoppin-1 est incapable de tuer des cellules tumorales, probablement à cause de son incapacité à traverser la membrane cellulaire. Un nouveau peptide stoppin-2 a été conçu à partir de stoppin-1 par substitution de 5 résidus en résidus Arg formant ainsi un groupe de résidus cationiques destinés à faciliter l’entrée du peptide dans les cellules tumorales. Stoppin-2 possède une affinité pour synMDM2 similaire à stoppin-1, en revanche contrairement à stoppin- 1, stoppin-2 est capable de réduire drastiquement la viabilité de cellules tumorales.

Une autre exemple de conception de ligand protéique utilisant la similarité de structure secondaire entre un ligand de référence et une protéine plate-forme a permis de concevoir un analogue peptidique de 31 résidus qui mime une protéine plaquettaire de plus grande taille, le facteur anti-héparinique 4 (PF4) (Butcher et al., 1997). La plate-forme structurale choisie pour le transfert de motif de liaison est le peptide « leucine zipper » GCN4, dont la fonction et la séquence sont totalement différentes de la protéine PF4. Cependant, la structure tridimensionnelle de la plate-forme GCN4 consistant en deux hélices " enroulées en hélice l'une autour de l'autre grâce à des résidus leucine, présente des similarités avec la protéine PF4 (Figure I.14). L’activité de liaison à l’héparine de PF4 a été introduite uniquement par incorporation de 4 lysines de PF4 dans des positions équivalentes sur les hélices de la plate- forme GCN4.Des expériences de dichroïsme circulaire et des tests de liaison ont montré que le peptide « leucine zipper » conçu, appelé PF4zip, adopte une conformation hélicoïdale stable et

Figure I.14 : A : Structures cristallographiques du dimère PF4 (à gauche) et du domaine « leucine zipper » modifié PF4zip (à droite). Les résidus Lys essentiels dans la liaison à l’héparine sont représentés sur les deux protéines en mode bâtons et boules

en rouge. B : Séquences de la protéine naturelle PF4 ainsi que de la plate-forme naturelle GCN4zip dans laquelle 4 lysines ont été introduites pour donner la plate-forme modifiée PF4zip (Butcher et al., 1997).

L'approche de transfert de motifs de liaison utilisant la similarité de structure secondaire entre le ligand de référence et la protéine plate-forme a également été appliquée à la conception d’inhibiteurs de l'interaction entre la glycoprotéine membranaire plaquettaire IIb-IIIa (GPIIb-IIIa) et le fibrinogène. La GPIIb-IIIa est une protéine présente à la surface des plaquettes circulantes et est impliquée dans les phénomènes d'agrégation plaquettaire conduisant à la thrombose, suite à sa liaison avec le fibrinogène. L’inhibition de la liaison entre GPIIb-IIIa et le fibrinogène constitue donc une cible thérapeutique stratégique dans la prévention de la thrombose artérielle. La liaison se produit grâce à la reconnaissance par la sous unité GPIIIa du motif RGD présent dans la séquence du fibrinogène. Afin de déterminer le mode d'interaction entre la GPIIIa et le fibrinogène, un anticorps monoclonal AC7 a été produit contre un peptide synthétique dérivé du fragment de GPIIIa responsable de la liaison au motif RGD. Il a été démontré que l'anticorps AC7 interagissait avec les plaquettes actives par l'intermédiaire de la chaîne lourde du CDR3 (H3) qui possède une séquence RQMIRGYFDV montrant une certaine homologie avec le motif RGDF du fibrinogène. Un décapeptide synthétique correspondant à la séquence RQMIRGYFDV de H3 inhibe l’agrégation plaquettaire et la liaison du fibrinogène aux plaquettes avec un IC50 de 700 µM. Ce résultat suggérait que le motif RGXFD de H3 a une structure qui mime la structure en coude ! de type II' de la séquence RGDF du fibrinogène permettant la reconnaissance du récepteur (Jarrin et al., 1994). Le décapeptide a donc été étudié par spectroscopie RMN et les résultats montrent que la conformation d’interaction serait une hélice " ; dans cette conformation, l’arrangement tridimensionnel des résidus R, G, D et F du décapeptide est similaire à celui des résidus R, G, D et F dans une conformation en coude ! de type II’ présente dans les antagonistes de GPIIb-IIIa. Afin de contraindre la séquence du décapeptide à

une conformation en hélice ", la toxine de scorpion leiurotoxin I, adoptant une structure "/! (une hélice " N-terminale reliée par trois ponts disulfures à deux feuillets ! antiparallèles à l’extrémité C-terminale), a été utilisée comme plate-forme. L’hélice " de la leiurotoxin I est alors remplacée par la séquence de H3, légèrement modifiée afin de préserver les ponts disulfures (NQCIRGCFDV). La toxine modifiée H3-leiurotoxin possède la même structure que la toxine native et montre une activité identique à celle du décapeptide. En effet, des essais d’inhibition de l'agrégation plaquettaire montrent que la toxine modifiée possède un IC50 de 200 µM (Mer et al., 1998).

Smith et ses collaborateurs ont effectué des travaux similaires à ceux du groupe de Jarrin fondés sur la création de nouvelles interfaces protéine-protéine grâce à l’utilisation d’une stratégie de transfert de boucles flexibles présentes à la surface de la plupart des protéines et qui sont souvent impliquées dans les phénomènes de liaison entre protéines (Smith et al., 1995). Dans cette stratégie, la séquence en acides aminés d’une boucle flexible possédant une activité biologique portée par une protéine, est utilisée afin de remplacer une boucle présente sur une protéine indépendante. Pour illustrer cette approche, la boucle HCDR3 de l’anticorps monoclonal Fab-9 dirigé contre les intégrines b3 a été greffée à la place d’une boucle de surface présente sur le module EGF de l’activateur tissulaire du plasminogène humain (t-PA). L’anticorps Fab-9 se lie aux intégrines b3 avec une affinité nanomolaire (Smith et al., 1994) grâce à la séquence de liaison SFGRGDIRN contenue dans la boucle HCDR3 stabilisée par deux ponts disulfures, en revanche, des peptides synthétiques contenant cette séquence ont une affinité 100 fois moins importante envers les intégrines b3. Cette séquence doit donc être transférée sur une plate-forme structurée afin de conserver l’affinité pour la cible. Le module EGF a été choisi pour le transfert de cette boucle car les structures de plusieurs protéines contenant ce module sont disponibles ; ces structures montrent que le module EGF contient une boucle exposée caractérisée par une structure en coude ! et stabilisée par la présence de deux ponts disulfures. La plate-forme t-PA a donc été mutée par transfert des résidus SFGRGDIRN à la place de la boucle de structure équivalente dans le module EGF. Le variant LG-t-PA ainsi obtenu a gardé une activité enzymatique similaire à la t-PA native envers son substrat synthétique et envers son substrat naturel le plasminogène, et est stimulé de façon normale par le cofacteur physiologique : la fibrine. Ce variant se lie de manière spécifique à l’intégrine plaquettaire aIIbb3 avec une affinité nanomolaire (Kd environ 0,9 nM) similaire à Fab-9 (Kd

de 5 nM) et à l’intégrine aVb3 avec un Kd de 1,8 nM similaire au Kd de 1,7 nM obtenu avec Fab-9. Des expériences de compétition avec un peptide synthétique contenant la séquence RGD connue pour bloquer la liaison des ligands aux intégrines confirment que LG-t-PA se lie aux intégrines b3 testées au niveau de leur site de liaison au ligand.

I.4.4.3.2 Recherche de plates-formes non fondée sur la similarité des structures