Production des plates-formes par voie recombinante chez E coli

Les gènes synthétiques, optimisés pour une expression recombinante des mini-protéines chez la bactérie E. coli, contiennent une séquence non canonique du site de clivage par la TEV protéase (ENLYFQ) suivie par la séquence correspondant à la mini-protéine d'intérêt ayant le motif fonctionnel à greffer à l'extrémité N-terminale, ainsi que les sites de recombinaison Gateway de part et d'autre du gène synthétique.

Ces gènes ainsi construits sont clonés dans le vecteur de destination pETG-82A, contenant la protéine de fusion DsbC ainsi que l’étiquette 6(His), par un clonage LR Gateway™. Les

plasmides d'expression obtenus codent pour une protéine de fusion constituée de :

Protéine DsbC – Etiquette 6(His) - Site de clivage TEV protéase - Mini-protéine d'intérêt

La protéine DsbC est utilisée comme partenaire solubilisant et oxydant permettant la production chez la bactérie E. coli de protéines de petites tailles et ayant des ponts disulfures. En effet, la protéine DsbC utilisée en fusion permet d’augmenter la taille de la mini-protéine d’intérêt et est également impliquée dans l’isomérisation des ponts disulfures. L’étiquette 6(His) permet la purification par affinité de la protéine de fusion sur une colonne de nickel et la protéase TEV permet le clivage de la mini-protéine d’intérêt de la protéine de fusion.

Les différents variants des mini-protéines ont été obtenus à partir des plasmides d'expression précédemment décrits en réalisant la mutagénèse dirigée par PCR. Les séquences des plasmides d'expression ont été vérifiées par séquençage (Eurofins MWG).

VI.2 Production des mini-protéines d'intérêt

Pour la production des protéines recombinantes chez E. coli, un protocole de co- expression a été mis au point, reposant sur l’utilisation de l’enzyme sulfhydrile oxydase Erv1p afin de catalyser la formation des ponts disulfures des mini-protéines d’intérêt dans le cytoplasme d’E. coli.

Pour ce faire, une souche Escherichia coli BL21-star a été transformée par un protocole de choc thermique par le plasmide d'expression portant le gène de la mini-protéine d'intérêt ainsi que le plasmide pMJS9 portant le gène codant pour la sulfhydrile oxydase Erv1p, puis mise en culture à 37 °C pendant une nuit dans 10 mL de milieu LB additionné d'ampicilline et de chloramphénicol à des concentrations finales de 100 µg/mL et 30 µg/mL respectivement. Le milieu ZY (925 mL) a été reconstitué en ajoutant 50 mL d'une solution NPS 20X, 20 mL de glycérol 50X, 1 mL de MgSO4 à 1M, 1 mL d'ampicilline à 100 mg/mL et 1 mL de

chloramphénicol à 30 mg/mL. Le milieu de culture ainsi préparé a été inoculé avec la pré- culture puis mis en incubation à 30 °C sous agitation à 200 rpm. Lorsque la DO à 600 nm a atteint 0,8, l'expression de la sulfhydrile oxydase a été induite par ajout de 20 mL d'une solution d'arabinose 50X. Après 30 min d'incubation à 20 °C, l'expression de la protéine recombinante a été induite par ajout de 1 mL d'IPTG à 1M et l'incubation a été poursuivie à 20 °C pendant une

nuit.

VI.3 Extraction et purification des protéines de fusion

Les cellules bactériennes ont été récupérées par centrifugation (4500 g, 30 min, 4 °C, rotor JS4.2) et le culot a été ressuspendu dans 50 mL de tampon de lyse (100 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5% glycérol). Les cellules ont ensuite été éclatées dans un système de désintégration de cellules (cell disrupter, Constant System Ltd) permettant de libérer le contenu cytoplasmique des cellules. Le lysat obtenu a été centrifugé (18 000 rpm, 30 min, 4 °C, rotor JA20) et le surnageant contenant la protéine de fusion a été récupéré. La protéine de fusion a par la suite été isolée du mélange cellulaire par purification sur une colonne de nickel HisTrap FF de 5 mL (GE-Healthcare Bio-Sciences) permettant de fixer l’étiquette 6(His) contenue dans la protéine de fusion. La colonne a été préalablement équilibrée avec 25 mL de tampon A (100 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5% glycérol, 40 mM Imidazole). Après chargement du surnageant sur la colonne à un débit de 2 mL/min, la résine a été lavée avec 25 mL de tampon A et la protéine de fusion portant l'étiquette 6(His) a ensuite été éluée par un gradient de tampon contenant une concentration croissante en imidazole permettant de décrocher la protéine de fusion de la colonne par phénomène de compétition : gradient linéaire (0 à 100% B en 30 min) de tampon B (100 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5% glycérol, 500 mM Imidazole) à un débit de 2 mL/min. Un suivi de l’absorbance à 280 nm a été réalisé durant toutes les étapes de chargement du surnageant, de lavage de la colonne et de l’élution de la protéine de fusion. Les différentes fractions contenant la protéine de fusion ont été regroupées.

VI.4 Clivage et purification des mini-protéines d’intérêt

La solution protéique contenant la protéine de fusion a été soumise à une dialyse en boudin (Spectra/PorÆ Dialysis Membrane ; MWCO : 3500) pendant 3 h contre le tampon C (50 mM Tris-HCl, pH 8), compatible avec l’activité de la TEV protéase. La protéine d'intérêt a ensuite été clivée avec 10% (masse/masse) de TEV protéase pendant une nuit à 4 °C. La solution de clivage a été centrifugée afin d’éliminer le précipité qui se forme après clivage, puis le surnageant est filtré sur des membranes 0,45 µm. Le surnageant issu du clivage, contenant la protéine d’intérêt libre mais également la TEV protéase ainsi que la protéine DsbC portant l’étiquette 6(His), est purifié par RP-HPLC sur une colonne C4 (Vydac 214TP1010, 10 µm, 300

Å, 10x250 mm) en utilisant un gradient non linéaire de solvant B (90% ACN, 10% H2O, 0,09%

TFA) dans le solvant A (95% H2O, 5% ACN, 0,1% TFA) à un débit de 4 mL/min. Les protéines

purifiées ont été lyophilisées puis solubilisées dans le tampon approprié pour les études ultérieures.

VII. Caractérisation des mini-protéines produites par synthèse chimique et par voie