Recherche moléculaire des gènes codant pour des BLSE

Les résultats de l’amplification des gènes des BLSE par PCR standard ont montrée que sur les 110 souches de PMP étudiées, 60 (54,55%) souches sont positives et produisent une ou plusieurs enzymes de BLSE (dont la même souche peut avoir plusieurs gènes à la fois) donnant ainsi 67 profils (Figures 23 à 26).

L’analyse des séquences nucléotidiques des produits de PCR purifiés des gènes des 60 souches positives a montré que :

119 -53 (88,33%) souches de PMP sont productrices de bla_TEM, dont 49 souches sont des P. mirabilis (avec 38 souches produit bla_TEM-1 et 11 bla_TEM-2), 3 souches sont des P. vulgaris (avec 1 souche produit blaTEM-1 et 2 blaTEM-2) et une souche de M. morganii productrice de blaTEM-1,

-3 (5%) souches de P. vulgaris sont productrices de blaPER-1, -1 (1,67%) souche de P. vulgaris est productrice de blaSHV-11.

-Aucune souche ne possède une β-lactamases de type blaVEB et blaGES.

Le support génétique des enzymes BLSE produits par les 60 souches de PMP isolées productrices de BLSE dans notre étude était varié. La majorité de nos BLSE sont dérivées des mutants de gène blaTEM. Au cours des dernières années, plusieurs nouvelles BLSE de type non-TEM ont émergé, comme blaCTX, blaSHV, blaSFO, blaBES, blaBEL, blaTLA, blaGES, blaPER et blaVEB [325].

- Dans notre série de souches, le support moléculaire principal expliquant la résistance de BLSE était la présence de gènes bla_TEM chez 53 souches dont 40 (75.74%) d’entre elles produisent une β-lactamase de type TEM-1. Nos résultats sont en accord avec ceux de Palzkill et Botstein qui rapportent que le gène bla_TEM-1 (plasmidique) est le plus répandu chez les bactéries à Gram négatif [326]. Telle que rapportée dans la littérature, sa fréquence chez les Enterobacteriaceae peut dépasser les 61% [327].

- La présence du gène bla_SHV-11 n'a été observée que chez une seule souche de P. vulgaris. Ce géne est différent par une substitution Leu-Gln sur l'acide aminé 35 par rapport au gène SHV-1, et diffèrent l'un de l'autre uniquement en position 1 du codons 238 et 240. Ce gène a été précédemment décrit chez K. pneumoniae [328, 329] mais jamais

chez une souche appartenant au groupe PMP.

- La prévalence de β-lactamases de type CTX-M a augmenté de façon spectaculaire depuis 1992 [37], ce sont, probablement, les enzymes les plus répandues actuellement chez les entérobactéries [44]. Ces enzymes confèrent un haut niveau de résistance au céfotaxime plus qu’à la ceftazidime. Cependant, les BLSE de type CTX-M hydrolysant la ceftazidime ont été récemment rapportées, tels que blaCTX-M-15 ou blaCTX-M-19 [330].

120 Dans notre étude, 10 souches de P. mirabilis productrices de BLSE de type CTX-M-15 ont été isolées. Ce gène est diffèrent d’une paire de base (pb) par rapport au gène blaCTX-M-3 grâce à un seul changement d'acide aminé (Asp240 → Gly), il en résulte un nouveau gène blaCTX-M [331]. Le blaCTX-M-15 a été décrit pour la première fois en Inde en 2001 [332]. il a ensuite été identifiée et semble être épidémique dans plusiers pays : Pologne [331], Turquie [333], Royaume-Uni [334], Russie [335], Taïwan [336], Canada [337], France [338], Bulgarie [339], Portugal [340], Liban [341]et en Corée [342]. Les rapports concernant la présence de blaCTX-M-15 en Afrique, avant sa découverte en Algérie, étaient limités au Sénégal [343], en Tanzanie [344] et au Cameroun [345]. Pour l'Algérie, seule blaCTX-M-3 produite par Salmonella enterica sérotype Senftenberg a été rapporté en 2005 [346]. Mais en 2006, Touati et al. [330] ont décrit pour la première fois la présence de blaCTX-M-15 en Algérie chez deux entérobactéries (E. coli et K. pneumoniae), et ce n’est qu’en 2009 que cette enzyme a été retrouvée chez P. mirabilis à Alger, pour la première fois [347]. Ce phénomène pourrait s'expliquer par le transfert horizontal et la propagation de plasmides portant le bla_CTX-M-15 chez les differents genres des Enterobacteriaceae ainsi que la dissemination clonale de microorganismes producteurs de ce gène.

- Les β-lactamases de type bla_PER ne sont pas très courament identifiées [348], elles sont de plus en plus signalées, avec la découverte du gène bla_PER-1, qui a été identifiés chez plusieurs espèces à Gram-négatif, notamment Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, P. mirabilis, P.vulgaris et P.stuartii [349-352]. Ce déterminant BLSE a été détecté dans plusieurs pays d'Europe, comme la France, la Pologne, le Kosovo [353] et l'Italie [350, 354] et est particulièrement répandu dans différentes espèces en Turquie [349]. Il a été également identifié en Corée chez Providencia spp. [351], et plus récemment, la propagation du gène blaPER-1 a été rapportée pour la première fois chez deux espèces d'entérobactéries, P. vulgaris et P. stuartii, isolées à Alger en 2009 [352] et depuis cette date aucun rapport sur des souches porteuses de ce gène n’a été publiée en Algérie jusqu'au 2011, au cours de notre travail, avec l’isolement de 3 souches de P. vulgaris productrices de blaPER-1. Selon la littérature, cette enzyme est souvent codée par un plasmide, mais elle peut également être associée à des éléments transposables facilitant la diffusion rapide dans différentes populations bactériennes [349].

Figure 23. Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du

M : marqueur de tailles de l’ADN, Pb : paire de bases, T+ 519 pb 519 pb 519 pb 519 pb 519 pb M M M T+ M T+ M

Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du gène blaCTX.

M : marqueur de tailles de l’ADN, Pb : paire de bases, T+ : temoin positif. T+ Mes souches Mes souches Mes souches Mes souches Mes souches 121 Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du

: temoin positif.

T+ T+

Figure 24. Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du 860 pb M T+ 860 pb M T+ 860 pb M T+ 860 pb M T+ 860 pb M T+

Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du gène bla_TEM.

Mes souches Mes souches Mes souches Mes souches Mes souches 122 Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du

Figure 25. Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du 1051 pb M T+ 1051 pb M T+ 1051 pb M T+ 1051 pb M T+ 1051 pb M T+

Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du gène bla_SHV. Mes souches Mes souches Mes souches Mes souches Mes souches 123 Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du

Figure 26. Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du 738 pb M 738 pb M 738 pb M 738 pb M 738 pb M

Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du gène blaPER.

Mes souches Mes souches Mes souches Mes souches Mes souches 124 Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits d’amplification par PCR du

5.2.Recherche moléculaire des carbapénèmases