Recherche de conditions optimales pour la catalyse

Maintenant que nous savons qu’il est nécessaire de ne pas dépasser le ratio 1:2 (Cu(II):monomère), j’ai pu chercher à optimiser les conditions de réaction en faisant varier d’autres paramètres physicochimiques tels que la nature du tampon, la température ou les co-solvants.

I.5.6.1 Effet du tampon

Trois différents tampons ont été testés dans l’espoir d’améliorer l’énantiosélectivité de la catalyse. Les résultats sont résumés dans le tableau 113. Nous observons tout d’abord que les rendements du cuivre (II) sont plus bas que d’ordinaire, et du même ordre de grandeur voir au-dessous de ceux du biohybride. Ce résultat, notamment concernant le MOPS qui est un réplicat de l’expérience ci-dessus, est pour l’instant inexpliqué. Les résultats concernant le biohybride sont néanmoins cohérents entre eux et peuvent donc être analysés.

Tableau 113 : Effet du tampon sur la catalyse par le variant A3sF119NPH. Catalyse de Diels-Alder entre l’azachalcone (1 mM) et le cyclopentadiène (34 mM) avec différents tampons. Conditions : 30 µM de monomère A3s du variant A3sF119NPH, 15 µM (0,5 équiv.) de Cu(NO3)2. 34 mM

cyclopentadiène (2267 équiv.), 1 mM azachalcone (66 équiv.) dans CH3CN (1% final), tampon

MOPS 20 mM pH 7,HEPES 20 mM pH 7, Na-Phosphate 50 mM pH 7, tous les tampons contenant 150 mM NaCl, 48h, 4°C. Toutes les expériences ont été faites en duplicat. La métallation est faite la veille de l’expérimentation, la protéine étant dans le tampon MOPS.

Monomère Ratio

Cu(II):Monomère Tampon pH Durée Cosolvant ee endo (%) Rendement (%)

0:- 2 ± 3 2 ± 1 1:- 1 ± 1 7 ± 4 0:- 2 ± 3 2 ± 1 1:- 1 ± 3 6 ± 1 0:- 3 ± 2 2 ± 1 1:- 2 ± 1 8 ± 2 0:2 18 ± 2 2 ± 1 1:2 57 ± 2 8 ± 1 0:2 12 ± 4 3 ± 1 1:2 53 ± 1 10 ± 1 0:2 11 ± 6 2 ± 1 1:2 53 ± 2 9 ± 1 A3sF119NPH MOPS 7 48h - NaP HEPES - MOPS NaP HEPES

171 Concernant le biohybride, nous pouvons observer d’une manière générale que la nature du tampon semble peu affecter le rendement. Concernant la sélectivité, nous pouvons observer une légère baisse dans les tampons phosphate et HEPES. De manière intéressante, le tampon HEPES ne semble donc pas beaucoup affecter la sélectivité somme il était soupçonné précédemment. Tout porte donc à croire que c’est le tampon MES qui agirait d’une manière négative. Il est néanmoins à savoir que, dans un soucis de reproductibilité, la métallation s’est effectuée dans le tampon MOPS et que le mélange réactionnel en contient donc à hauteur de 17%. Il se peut donc que la métallation soit l’étape critique pour la sélectivité du biohybride, et qu’une fois le complexe formé il est alors plus stable dans différentes conditions. N’ayant pas obtenu d’amélioration, nous avons décidé de tester les autres paramètres que sont la température et le cosolvant. Les prochaines catalyses ont été effectuées avec un léger sous-excès de cuivre (0,6:2 Cu(II):monomère) par rapport à un demi-équivalent molaire, afin d’assurer la formation la plus complète du supposé complexe de bis-phénanthroline de cuivre. La condition standard utilisée jusqu’ici étant une température de 4°C et pas de cosolvant ajouté (à part le 1% d’acétonitrile final correspondant à l’ajout du substrat).

I.5.6.2 Effet de la température

Trois températures été utilisés : 4°C, 15°C et 25°C. Les résultats de catalyses sont donnés dans le tableau 114.

Tableau 114 : Effet de la température sur la catalyse par le variant A3sF119NPH. Catalyse de la réaction de Diels-Alder entre azachalcone et cyclopentadiène dans différentes conditions de température. Catalyseur A3sF119NPH incubé ou non avec 0,3 équiv. de Cu(NO3)2 (par rapport au

monomère A3s) La condition à 4°C est celle utilisée précédemment. 34 mM cyclopentadiène (3778 équiv.), 1 mM azachalcone (110 équiv.) dans CH3CN (1% final), tampon MOPS 20 mM pH 7, 150

mM NaCl, 48h. Toutes les expériences ont été faites en duplicat.

Une augmentation de la température sur le rendement de réaction semble néfaste : partant de 7,2% à 4°C, le rendement du biohybride décroit jusqu’à 1,6% à 25°C. Ceci est probablement dû à la dimérisation spontanée du cyclopentadiène, qui diminue la quantité de réactif disponible pour la réaction. Ceci est également valable pour la protéine non métallée dont le rendement, bien que déjà faible, passe de 2,6% à 1,2% entre 4°C et 25°C.

Monomère Ratio

Cu(II):Monomère Tampon pH Durée Température Cosolvant ee endo (%) Rendement (%)

4°C 22 ± 11 5 ± 1 15°C 21 ± 2 3 ± 1 25°C 8 ± 1 2 ± 1 4°C 60 ± 2 12 ± 2 15°C 64 ± 2 8 ± 1 25°C 45 ± 17 3 ± 1 48h A3sF119NPH - 0,6:2 0:2 MOPS 7

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Cet effet de dimérisation du substrat a déjà été décrit et justifie pourquoi la plupart des études de catalyse de la réaction de Diels-Alder sont effectuées à 4°C 18_.

Concernant l’effet de la température sur l’excès énantiomérique, on observe tout d’abord que la protéine non métallée possède toujours une sélectivité (soit par contamination par le cuivre, soit par effet « template », comme expliqué précédemment). Partant d’un excès énantiomérique d’environ 22% à 4°C, la sélectivité décroit jusqu’à 8% à 25°C. Concernant le biohybride, la sélectivité reste haute (60-64% à 4-15°C) même si elle semble décroitre à 25°C pour atteindre 45%, ce chiffre est à relativiser, la marge d’erreur étant grande à cette température.

Finalement, une augmentation de la température ne permet pas d’améliorer l’excès énantiomérique et conduit par aussi à une baisse du rendement de la réaction. La température de 4°C précédemment utilisée est donc bien la condition de température optimale.

I.5.6.3 Effet des cosolvants

Les trois cosolvants, pouvant favoriser la solubilité des substrats, ont été choisis pour leur coefficient de partage octanol/eau différents (logP de -0,3 ; 0,05 et 0,4 pour acétonitrile, isopropanol et tert-butanol respectivement). Les résultats sont résumés dans le tableau 115.

Tableau 115 : Effet des cosolvants sur la catalyse par le variant A3sF119NPH Catalyse de la réaction de Diels-Alder entre azachalcone et cyclopentadiène dans différentes conditions de cosolvant. Catalyseur A3sF119NPH incubé ou non avec 0,3 équiv. de Cu(NO3)2 (par rapport au monomère

A3s). Dans toutes les conditions de cosolvant, 1% d’acétonitrile est présent en plus, provenant de la solution de substrat. 34 mM cyclopentadiène (3378 équiv.), 1 mM azachalcone (110 équiv.) dans CH3CN (1% final), tampon MOPS 20 mM pH 7, 150 mM NaCl, 48h, 4°C. Toutes les expériences ont

été faites en duplicat.

Monomère Ratio

Cu(II):Monomère Tampon pH Durée Température Cosolvant ee endo (%) Rendement (%)

- 22 ± 11 5 ± 1 5% ACN 11 ± 5 6 ± 1 10% ACN 6 ± 3 7 ± 0 5% IsoOH 7 4 10% IsoOH 8 ± 4 5 ± 1 5% t-ButOH 9 ± 7 5 ± 1 10% t-ButOH 4 ± 2 6 ± 1 - 60 ± 2 12 ± 2 5% ACN 51 ± 1 13 ± 2 10% ACN 36 ± 2 11 ± 2 5% IsoOH 47 ± 4 10 ± 1 10% IsoOH 47 ± 1 8 ± 1 5% t-ButOH 52 ± 1 11 ± 1 10% t-ButOH 47 ± 2 9 ± 1 0,6:2 A3sF119NPH 0:2 MOPS 7 48h 4°C

173 Concernant l’effet des cosolvants, les tendances sont comparables à celles pour la température : chez la protéine avec ou sans métal la sélectivité et le rendement semblent affectés négativement, quel que soit le type de cosolvant utilisé. Nous avions vérifié par des expériences de dichroïsme circulaire que la protéine restait repliée en hélices α en présence de 10% d’acétonitrile, ces mesures ayant été faites 24h heures après l’ajout de solvant. Cependant, il est possible que la présence de solvant organique modifie les propriétés dynamiques de la protéine sans pour autant affecter ses structures secondaires, qui perd donc sa capacité à générer un environnement propice à la catalyse énantiosélective.

La condition la plus favorable à une catalyse énantiosélective est donc un taux minimal de cosolvant.

I.5.6.4 Effet des concentrations en substrats

Fort de ces résultats, j’ai tenté de déterminer si la concentration en substrats pouvait avoir un impact positif sur l’excès énantiomérique ou le rendement, l’hypothèse principale étant une inhibition par le produit. J’ai donc fait varier les deux paramètres indépendamment en diminuant de moitié ou du quart la quantité ajoutée de chacun des substrats. Les concentrations finales sont donc de 1 mM ; 0,5 mM ; 0,25 mM d’azachalcone et 33,8 mM ; 16,9 mM ; 8,45 mM de cyclopentadiène. Les résultats sont reportés dans le tableau 116.

Tableau 116 : Effet de la concentration en substrats sur la catalyse par le variant A3sF119NPH. Catalyse de la réaction de Diels-Alder entre azachalcone et cyclopentadiène par le biohybride A3sF119NPH métallé puis dessalé par tamis moléculaire. Condition normale : 34 mM cyclopentadiène (2266 équiv.), 1 mM azachalcone (66 équiv.) dans CH3CN (1% final), tampon

MOPS 20 mM pH 7, 150 mM NaCl, 48h, 4°C. Toutes les expériences ont été faites en duplicat.

Nous pouvons tout d’abord remarquer que dans les conditions normales (identiques à la ligne « 1,5 équiv. + tamis » de la figure 112), l’excès énantiomérique est plus faible (40% contre 62%) tandis que le rendement est plus élevé (28% contre 11%). Cette disparité n’est pas encore tout à fait expliquée et peut être due à un lot plus récent du substrat azachalcone ainsi qu’à une nouvelle préparation de la protéine.

Lorsque l’on baisse la concentration en azachalcone, le rendement et l’excès énantiomérique se trouvent augmentés. L’augmentation du rendement peut s’expliquer

Monomère Ratio

Cu(II):Monomère Tampon pH Durée Cosolvant

[azachalcone] (mM) [cyclopentadiene] (mM) ee endo (%) Rendement (%) 1 34 40 ± 2 28 ± 4 0,5 52 ± 1 52 ± 11 0,25 60 56 17 43 ± 1 8 ± 2 8,5 43 ± 2 5 ± 1 34 1

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par une inhibition par le produit, étant donné qu’à rendement équivalent la concentration de produit dans le milieu réactionnel est plus faible.

La baisse de la concentration de cyclopentadiène ne semble pas impacter l’excès énantiomérique de la réaction catalysée par le biohybride (43% contre 40% ee). En revanche, le rendement de la réaction se trouve très fortement abaissé (de 28% à 8% puis 5% pour des concentrations respectives en cyclopentadiène de 33,8 mM, 16,9 mM et 8,45 mM). Cette baisse de rendement dénote une mauvaise affinité entre la protéine et le cyclopentadiène. Nos résultats confortent un mécanisme réactionnel en deux étapes décrit précédemment 13 _{: tout d’abord la fixation de l’azachalcone sur le cuivre}

dans une position privilégiée par l’environnement protéique favorisant l’exposition d’une face donnée de la molécule vers le cyclopentadiène.

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I.5.7 Modèle proposé pour le biohybride A3sF119NPH_Cu

Compte tenu de l’ensemble de ces résultats, nous soumettons donc l’hypothèse selon laquelle le centre catalytique au sein du biohybride A3sF119NPH serait une bis- phénanthroline de cuivre. Le dimère étant symétrique, les deux monomères devraient se comporter de façon équivalente face à la fixation d’un objet achiral : si les deux phénanthrolines ne chélatent qu’un seul cuivre, il est probable qu’elles le fassent de la même façon. Dans cette configuration, l’entité catalytique formerait une symétrie de 180° autour d’un axe passant par le cuivre. Le site catalytique demeure chiral, mais l’accès est alors possible au substrat dans deux orientations.

Figure 117 : Modèle proposé pour la structure de l'entité catalytique de A3sF119NPH en présence de cuivre. Ce catalyseur présentant une symétrie cristallographique de type C2, l’environnement resterait chiral avec cependant deux sens d’arrivée du substrat possibles après une rotation de 180°. Le cyclopentadiène viendrait après la fixation de l’azachalcone pour former la forme endo ou exo correspondante.

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