La connaissance de l’environnement protéique autour de la phénanthroline pouvant être d’une grande aide pour trouver les résidus constituant la « seconde sphère de coordination » des substrats, j’ai donc entrepris d’obtenir la structure cristallographique avec les conseils du Dr Inès Gallay. Le dimère αRep-A3 présente également une capacité à former des cristaux dans un large éventail de conditions. Il est tout d’abord apparu que les biohybrides cristallisaient bien moins aisément que la protéine sauvage, avec une grande propension à former des sphérulites (figure 120). Je suis néanmoins parvenu à obtenir un certain nombre de cristaux, notamment pour les variants A3sY26NPH et A3sD150NPH.
Figure 120 : Formation de sphérulites, phénomène couramment observé lors des essais de cristallisation des différents variants.
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I.6.1 Structures du variant A3sY26NPH
Figure 121 : Cristaux obtenus en kit de criblage de cristallisation pour le variant A3sY26NPH contenant du zinc. Les conditions sont indiquées en dessous des images.
Plusieurs types de cristaux ont été obtenus pour le variant A3sY26NPH. Un premier cristal provenant d’une préparation contenant du zinc (figure 121A a été analysé sur la ligne PROXIMA1 du synchrotron SOLEIL. Nous avons pu obtenir des clichés à une résolution de 1,9 Å. Après traitement par remplacement moléculaire à l’aide de la structure de la protéine A3 sauvage, nous avons vite constaté que la structure était très proche de celle de la protéine non modifiée. Cependant la densité électronique se limitait uniquement à un résidu cystéine. Il semblerait donc que le peu de protéine non couplée à la phénanthroline présent dans cette préparation ait cristallisé. Nous n’avons donc pas continué l’affinement de la structure.
Un autre cristal (figure 121B) a été observé pour une préparation de protéine également en présence de zinc. Ce cristal a mis plusieurs mois à apparaitre (entre le 35e
jour et le 205e jour). Après diffraction à 2 Å sur la ligne PROXIMA1 également, j’ai tenté
de résoudre la structure. Un remplacement moléculaire par la protéine A3 sauvage a tout d’abord révélé que la structure du dimère était clairement modifiée. Comme nous pouvons voir sur la figure 122, les deux monomères sont décalés par un glissement des sous-unités encore plus important que celui de la forme « ouverte » de la protéine contenant la molécule de PEG.
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Figure 122 : Structure cristallographique du variant A3sY26NPH en présence de zinc. Les HisTag ont été retirés de la structure pour plus de clarté. La position des phénanthrolines est peu précise, la densité électronique dans cette zone étant particulièrement diffuse.
Nous pouvons conclure de ce résultat que le dimère αRep-A3, bien que très stable, présente une flexibilité inattendue. Il est donc possible que les différents biohybrides puissent présenter un glissement des sous-unités analogue, un ion métallique faisant le pont entre les deux sous-unités. Il faut cependant rester prudent concernant la possibilité de formation d’un complexe bis-phénanthroline de cuivre lors des expériences de catalyse concernant le variant A3sY26NPH. Tout d’abord, la structure cristallographique a été résolue pour la protéine en présence de zinc (des tentatives d’obtention de cristaux pour la forme avec cuivre n’ayant pas été concluantes). Ensuite, après une expérience de RPE menée sur ce variant ayant subi une étape de filtration sur gel, la double intégration du signal mesuré donnait une valeur intermédiaire entre le variant A3sF119NPH et la protéine sauvage en présence de cuivre. Il n’est donc pas à exclure la présence de deux populations différentes, passant progressivement d’un état de mono phénanthroline de cuivre à bis phénanthroline de cuivre après glissement des deux monomères. Ceci est en accord avec le fait que les cristaux aient mis un grand laps de temps avant d’apparaître : la population de forme bis-phénanthroline de zinc a probablement augmenté avec le temps jusqu’à atteindre un seuil de nucléation.
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I.6.2 Structure du variant A3sD150NPH
Sel Tampon pH Précipitant
0,45 M NaCl 0,1 M Phosphate de sodium 6,4 15 % (w/v) PEG 2000
Figure 123 : Cristaux obtenus après optimisation pour le variant A3sD150NPH en présence de zinc, les conditions de cristallisation sont notées en dessous.
Des cristaux du variant A3sD150NPH ont été également obtenus dans une condition en présence de zinc (figure 123). Après diffraction à une limite de 2 Å sur la ligne ID23 du synchrotron de l’ESRF de Grenoble, j’ai également effectué l’analyse par remplacement moléculaire en utilisant le monomère αRep-A3. On remarque une structure générale extrêmement proche de la forme « ouverte » de la protéine (PDB : 3LTM) et pour cause : la protéine semble également contenir une molécule de PEG au sein de la grande crevasse (non montré sur la figure).
La position D150 avait été choisie car le résidu était pointé non pas vers la crevasse principale mais vers une crevasse secondaire. La structure cristallographique confirme que la phénanthroline est bien dirigée vers cette crevasse (en rose, figure 124). Cependant aucun métal n’est visible dans la structure : la phénanthroline forme effectivement une liaison hydrogène avec la seule histidine de la protéine située à l’extrémité C-teminale.
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Figure 124 : Gauche : Alignement des structures de la protéine A3 (en vert, PDB : 3LTM) et de la structure déterminée pour le variant A3sD150NPH (en bleu). La protéine semble également contrenir une molécule de PEG provenant de la solution de cristallisation, à l’instar de la structure de la protéine sauvage (PDB : 3LTM) La phénanthroline est représentée en violet. Droite : vue de près de l’environnement de la phénanthroline, montrant les liaisons hydrogènes qu’elle effectue avec une histidine à la place d’un ion zinc.
I.6.3 Cristaux du variant A3sK30NPH
Figure 125 : A. Cristaux du variant A3sK30NPH en présence de zinc, aucun jeu de données en dessous de 7 Å de diffraction n'a pu être obtenu. B. Cristaux du variant A3sK30NPH en présence de cuivre, aucune diffraction n'a été obtenue.
Plusieurs types de cristaux ont été obtenus pour le variant A3sK30NPH (en présence de zinc ou cuivre). Cependant la résolution n’a pas pu être descendue en dessous de 7 Å, ce qui ne permettait pas d’avoir d’informations sur la position de la phénanthroline.
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