radioprotecteur de RhoB-F dans les cellules NIH3T3.

La mort mitotique pouvant également être induite par des réparations abérrantes des cassures de l’ADN, nous avons cherché à compléter ce travail visant à décrypter les mécanismes de l’effet radioprotecteur de la forme farnésylée de RhoB en analysant le rôle de cette protéine dans le système de réparation des CDB de l’ADN dans la régulation de la protéine contrôlant le cycle centrosomal et l’arrêt en phase G2.

2-1 Analyse du rôle de RhoB dans la protection contre les CDB et la réparation des

CDB radio-induites .

Les radiations ionisantes induisent des lésions sur l’ADN dont les cassures double brins (CDB) qui représentent la lésion cytotoxique majeure (Jeggo, 1998). Dans les cellules de mammifères, les CDB sont principalement réparées par un mécanisme de recombinaison illégitime : jonction d’extrémités non homologues (NHEJ). Plusieurs protéines participent à ce mécanisme de réparation, dont la protéine kinase dépendant de l’ADN (DNA-PK) qui comprend la sous-unité régulatrice Ku et la sous-unité catalytique DNA-PKcs et les protéines XRCC4 /ADN ligase IV.

Les travaux du laboratoire ont montré que l’expression du dominant négatif de RhoB dans la lignée HeLa rendue radiorésistante par surexpression du FGF-2, induisait une inhibition du système NHEJ en réduisant le taux intracellulaire de la DNA-PKcs et donc son activité (Ader, non publié). Ce résultat suggérant que RhoB est capable de réguler l’activité du NHEJ en contrôlant la DNA-PKcs, nous avons étudié si la radiorésistance des cellules NHI3T3 induite par la surexpression de RhoB et plus particulièrement sa forme farnésylée, pouvait être corrélée à la stimulation de la réparation des CDB après irradiation. Dans un premier temps, nous avons

déterminé si l’effet radioprotecteur de RhoB pouvait être dû à une meilleure protection de l’ADN vis à vis des CDB radio-induites. Nous avons ainsi comparé le taux de CDB au temps 0 (maximum de cassures) après une irradiation de 40 Gy pour les cellules transfectées par le vecteur vide, codant l’ADNc de RhoB-F ou de RhoB-GG (Fig.13A). Le taux de CDB après irradiation n’étant pas significativement modifié par l’expression de RhoB quelle que soit sa prénylation, nous avons analysé dans un second temps la cinétique de réparation des CDB dans les cellules NIH3T3 transfectées par les différentes formes prénylées de RhoB, en quantifiant le taux de CDB (exprimé en FAR) à différents temps après irradiation (Fig.13B). La cinétique de réparation des CDB après irradiation n’étant pas significativement modifiée par l’expression de RhoB quelle que soit sa forme, nous pouvons conclure que RhoB ne semble pas réguler la réparation des CDB dans ce modèle.

Parallèlement à cette étude du rôle de RhoB dans la réparation des CDB, nous avons déterminé si RhoB pouvait réguler le taux de la DNA-PKcs comme les travaux du laboratoire l’avait déjà montré dans les cellules HeLa. Nous avons donc déterminé le taux de la DNA-PKcs dans les différents clones NIH3T3 (Fig.13C). Nous n’avons pas observé de différence du taux intracellulaire de la DNA-PKcs dans les différents clones exprimant les différentes formes prénylées de RhoB par rapport aux cellules contrôle. Ces résultats suggérent que la voie moléculaire entraînant la radiorésistance des cellules NIH3T3 transfectées par la forme farnésylée de RhoB n’implique pas la DNA-PKcs.

84

2-2 Mécanismes moléculaires contrôlant l’accumulation des centrosomes surnuméraires après irradiation dans les cellules NIH3T3.

Nous avons observé que RhoB-F contrôle la surduplication des centrosomes radio-induite dans les cellules NIH3T3.Un grand nombre de protéines participent au contrôle du cycle centrosomal. Les protéines p21 et la nucléophosmine (NPM) présentent la particularité d’être aussi impliquées dans la réponse aux RI. La surduplication des centrosomes radio-induite étant inhibée dans les cellules d’adénocarcinome pancréatique MIA PaCa2 par la surexpression de p21 (Sato et al., 2000b), nous avons quantifié par Western Blot le taux intracellulaire de p21 dans les cellules NIH3T3 surexprimant les différentes formes de RhoB (Fig.14A). Nous ne mettons pas en évidence de variation significative du taux intracellulaire de p21 après irradiation dans les différents clones exprimant RhoB. Ces résultats suggérent que l’inhibition du nombre de centrosomes dans les cellules NIH3T3 surexprimant RhoB-F en réponse aux rayons n’est pas corrélée à une augmentation du taux intracellulaire de p21.

Une autre protéine décrite comme étant largement impliquée dans la régulation de la duplication des centrosomes (Okuda, 2002; Okuda et al., 2000; Tokuyama et al., 2001) : la NPM. Après exposition aux rayonnements γ , les cellules de carcinome squameux SQ20B présentent une augmentation de la forme ADP-ribosylée et phosphorylée de la NPM (Ramsamooj et al., 1995). De plus des travaux menés au laboratoire ont montré que la radiorésistance induite par le FGF-2 était associée à une augmentation de l’ARNm d’un variant d’épissage de la NPM. La surexpression de cette forme tronquée de la protéine dans les cellules HeLa entraîne une augmentation de la survie des cellules en réponse aux rayonnements γ (Dalenc et al., 2002). Pour déterminer si la radiorésistance induite par RhoB-F dans les cellules NIH3T3, associée à l’inhibition de la surduplication des centrosomes, pouvait être corrélée à une augmentation du taux intracellulaire de la NPM, (forme complète ou épissée) nous avons quantifié la concentration

cellulaire de la NPM dans les cellules NIH3T3 exprimant RhoB-F et RhoB-GG. Nous ne mettons pas en évidence de variation significative de l’expression de la NPM dans les différents clones suggérant que RhoB ne contrôle pas le taux intracellulaire de cette protéine dans les cellules NIH3T3 (Fig.14B). Cependant, il reste à déterminer si la protéine RhoB régule l’activité de la NPM en réponse au RI en contrôlant la phosphorylation de cette protéine dans les clones exprimant les différentes formes prénylées de RhoB.

Figure 14: Analyse de l’expression des protéines p21 et NPM dans les cellules NIH3T3.

A. 20 µg d’extrait protéique de cellules NIH3T3, contrôle (Mock), exprimant RhoB-F

(RhoB-F) ou exprimant RhoB-GG (RhoB-GG), sont analysés par western blot grâce à un anticorps anti p21.

B. 20 µg d’extrait protéique de cellules NIH3T3, contrôle (Mock), exprimant RhoB-F

(RhoB-F) ou exprimant RhoB-GG (RhoB-GG), sont analysés par Western Blot grâce à un anticorps anti NPM.

(représentatif d’au moins trois expériences indépendantes.)

A

p21 actine

Mock _{RhoB-F RhoB-GG}

B

actine

2-3 Mécanismes moléculaires contrôlant l’arrêt en G2 induit par l’expression de RhoB après irradiation dans les cellules NIH3T3.

Afin de déterminer si l’arrêt en G2 contrôlé par RhoB-F est du à une régulation du complexe MPF contrôlant le passage G2/M nous avons quantifié le taux intracellulaire des protéines Cdk1 et Cycline B1 dans les cellules NIH3T3 irradiées ou non, surexprimant les différentes formes de RhoB, (Fig.15). Nous ne mettons pas en évidence de variation significative du taux de cycline B1. Par contre nous montrons une augmentation du taux relatif de Cdk1 dans les cellules exprimant la forme farnésylée de RhoB dans les cellules non irradiées signifiant qu’il pourrait exister un lien entre cette forme de RhoB et la régulation du complexe Cdk1/CyclineB1 (p<0.05%). Cette étude doit être poursuivie en quantifiant l’activité de la kinase Cdk1 afin de déterminer si cette augmentation du taux intracellulaire de la protéine est corrélée à une stimulation ou à une inhibition de l’activité kinase.

L’expression de la forme farnésylée de RhoB entraîne une augmentation de l’arrêt en G2 des cellules NIH3T3 irradiées. Or l’arrêt en G2 est dû à l’inhibition de l’activité du complexe Cdk1/cyclineB1. Nous supposons que dans notre modèle, RhoB doit permettre l’accumulation de la forme inactive du MPF soit en modulant la phosphorylation de la protéine, soit en contrôlant sa localisation cellulaire. Ces hypothèses doivent être vérifiées et complétées par la mise en évidence du mécanisme contrôlé par RhoB permettant l’accumulation de la protéine Cdk1 dans les cellules NIH3T3.

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Taux Cdk1/actine/Mock

Mock RhoB-F RhoB-GG

Figure 15: Analyse de l’expression des protéines Cdk1 et cycline B1 dans les cellules NIH3T3.

A. 20 µg d’extrait protéique de cellules NIH3T3, contrôle (Mock) exprimant RhoB-F

(RhoB-F) ou exprimant RhoB-GG (RhoB-GG), sont analysés par Western Blot grâce à un anticorps anti Cdk1 (p<0.05%).

B. 20 µg d’extrait protéique de cellules NIH3T3, contrôle (Mock), exprimant RhoB-F

(RhoB-F), ou exprimant RhoB-GG (RhoB-GG), sont analysés par Western Blot grâce à un anticorps anti Cycline B1. Pas d’expression significativement différente entre les cellules exprimant RhoB-F et RhoB-GG .

L ’expression de la CdK1 et Cycline B1 est quantifiée avec le phosphorimageur et exprimée par le rapport du signal obtenu pour les cellules exprimant RhoB-F et RhoB-GG et celui des cellules contrôle Mock. Chaque point représente la moyenne +/- écart type de 3 expériences indépendantes.

A

B

Mock RhoB-F RhoB-GG

90