Le pourcentage de cellules avec un nombre de centrosomes >2 est quantifié à 24h après

irradiation. Chaque point représente la moyenne +/- écart type de 3 expériences indépendantes.

DAPI tubuline γ

% cellules

à

Figure 20: Analyse de l’expression de la protéine Cdk1 et de sa phosphorylation dans les cellules U87 après irradiation.

20 µg d’extrait protéique de cellules transfectées par les ARNi SiScr et SiRb1 est analysé par Western Blot avant irradiation (NI) ou 16h et 18h après irradiation grâce à un anticorps anti Cdk1. La position de la forme phosphorylée de CdK1(Cdk1-P) et de Cdk1(Cdk1) sont matérialisées par des flèches ainsi que celle de l’actine (actine). (représentatif d’au moins trois expériences indépendantes)

SiScR SiRb1

NI I - 18h I - 16h

Cdk1

Cdk1 P

actine

100

L’ensemble de ce travail m’a permis de démontrer que la protéine RhoB contrôle les mécanismes de radiorésistance cellulaire en induisant, quand elle est surexprimée dans des cellules radiosensibles une augmentation de la résistance aux RI et à l’inverse, quand elle est inhibée, une radiosensibilisation de lignées radiorésistantes. RhoB exerce cet effet régulateur via sa forme farnésylée en régulant les voies biologiques de la mort mitotique (probablement via le contrôle de l’arrêt en G2) et de la surduplication des centrosomes radio-induits. Ces résultats mettent en lumière une nouvelle voie biologique contrôlant les mécanismes de radiorésistance cellulaire, en particulier dans un modèle connu pour être radiorésistant, les glioblastomes.

Mes résultats ne permettent pas de mettre en évidence une régulation de la réparation des CDB radio-induites par RhoB dans les deux modèles étudiés. Les précédents travaux du laboratoire avaient démontré que l’inhibition de RhoB dans les cellules HeLa rendues radiorésistantes par la surexpression de la forme 24kDa du FGF2 (cellules HeLa 3A) radiosensibilisait ces cellules en inhibant la cinétique de réparation des CDB via une diminution du taux de la DNA-PKcs (Ader, non publié). Ceci suggère que la régulation des CDB que nous avions observées dans les cellules HeLa 3A après inhibition de RhoB était probablement due à un effet de l’expression de cette forme particulière du FGF2 dans ce modèle cellulaire. Même si l’arrêt en G2/M et la duplication anormale des centrosomes ont largement été reliés à des aberrations des systèmes de réparation des lésions de l’ADN (cf paragraphe centrosomes), il semblerait donc qu’il puisse exister des systèmes de régulations de l’arrêt en G2/M radio-induit qui n’agissent pas directement sur la réparation des CDB.

Mes résultats démontrent également que seule la forme farnésylée de RhoB est capable de diminuer la sensibilité des cellules à l’irradiation. Ceci suggère fortement que RhoB-F et RhoB- GG pourraient avoir des effecteurs différents en ce qui concerne les voies contrôlant la

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radiorésistance. Nous avons d’autre part montré qu’un effecteur des Rho, ROCK, était impliqué dans le contrôle des mécanismes de mort mitotique après irradiation uniquement dans les cellules surexprimant RhoB-F. Des travaux complémentaires sont menés au laboratoire pour identifier ces effecteurs.

D’autre part, nous avons montré que RhoB contrôlait la surduplication des centrosomes radio- induites. Cette anomalie du cycle centrosomal peut être due à une dérégulation d’au moins une des proteines impliquées dans ces mécanismes. L’analyse des protéines NPM, Cdk2 et p21 n’a pas permis de mettre en évidence de différence significative en ce qui concerne le taux intracellulaire de ces protéines dans les cellules surexprimant ou non RhoB. Mais RhoB pourrait aussi contrôler la régulation de l’activité du complexe Cdk2/CyclineE. En effet, de récents travaux montrent que les rayonnements g entraînent l’amplification de centrosomes dans les cellules HCT116 (tumeur du colon) corrélée à une augmentation du taux intracellulaire de la cycline E, protéine impliquée dans le complexe régulant la duplication des centrosomes (Cdk2/CyclineE) . Or la surexpression du facteur de transcription kruppel 4 dans des cellules HCT116 de tumeur du colon, entraîne une diminution des cellules à plus de trois centrosomes corrélée à la diminution de la cyclineE en réponse aux RI dans ce modèle cellulaire (Yoon et al., 2005). Il n’est pas exclu que RhoB soit capable de diminuer le taux de CyclineE, comme le facteur kruppel 4, afin d’inhiber la surduplication des centrosomes. RhoB peut également contrôler la phosphorylation de la NPM que nous avions déjà démontré comme étant impliquée dans les mécanismes de radiorésistance (Dalenc et al., 2002). La phosphorylation de cette protéine sera analysée afin de déterminer si RhoB peut contrôler la surduplication des centrosomes par ce mécanisme (Ramsamooj et al., 1995; Tokuyama et al., 2001). Cette surduplication des centrosomes a été reliée à l’induction de la mort mitotique après irradiation dans des cellules d’ostéosarcome (Sato et al., 2000a; Sato et al., 2000b). Mes résultats et les

données de la littérature suggèrent fortement que RhoB régule la mort mitotique radio-induite via le contrôle du cycle centrosomal.

La forme farnésylée de RhoB induit un arrêt prolongé en G2 après irradiation. Le complexe Cdk1/CyclineB1 contrôlant le passage du G2 en M, nous avons cherché à déterminer si RhoB était capable de réguler ce complexe. Nous avons mis en évidence une augmentation du taux intracellulaire de Cdk1 dans les cellules NIH3T3 surexprimant RhoB-F et une régulation de sa phosphorylation dans les cellules U87 transfectées par SiRb1. Toutefois, nous n’avons pas encore démontré que RhoB régulait l’activité de Cdk1 et donc du complexe MPF. De nombreux travaux ont largement décrit la régulation de Cdk1 par des successions de phosphorylation/dephosphorylation par les kinases Myt1 et Wee1 ou les phosphatases Cdc25. Les travaux de Manes et al. ont toutefois montré que les taux de l’ARNm, de la protéine et de l’activité de Cdk1 pouvaient également être régulés en particulier par la surexpression de l’intégrine avb3 dans des cellules de tumeurs prostatiques humaines LNCaP (Manes et al., 2003).

Nous chercherons à déterminer si RhoB est capable de moduler l’activité de Cdk1 en analysant l’activité kinase du complexe Cdk1/CyclineB1, s’il s’agit d’un contrôle de la transcription ou de la stabilité de la protéine, d’une régulation l’activité des kinases Myt1 et Wee1 inhibitrices de Cdk1 (Liu et al., 1997; McGowan and Russell, 1993; Porter and Donoghue, 2003), ou encore de l’activité de Cdc25 (Lopez-Girona et al., 1999).

Dans un modèle de glioblastomes humains radioresistant U87, RhoB contrôle donc la réponse cellulaire à l’irradiation. L’inhibition de la farnésylation dans ce modèle cellulaire conduit également à une radiosensibilisation des cellules U87 (Delmas et al., 2002)) ce qui suggère fortement que, comme dans les cellules NIH3T3, seule la forme farnésylée de RhoB est responsable de l’effet radioprotecteur. Ceci nous conduit à supposer que dans les cellules tumorales radiorésistantes, il pourrait exister soit un équilibre différent de la forme farnésylée par

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rapport à la forme géranylgéranylée, soit une activation préferentielle de la forme farnésylée. La radiosensibilisation induite par le FTI dans les cellules tumorales étant obtenue par traitement des cellules avant irradiation (Cohen-Jonathan et al., 1999; Delmas et al., 2002), la voie contrôlée par RhoB qui induit la radiorésistance cellulaire est activée, au moins en partie, indépendamment de l’irradiation. De plus, les travaux du laboratoire ont récemment démontré le rôle de RhoB dans le contrôle des voies de l’hypoxie cellulaire ( Skuli, soumis) et tumorale via l’angiogenèse (Ader et al., 2003)). Ces résultats et ceux obtenus pendant ma thèse définissent clairement RhoB comme une cible d’intérêt majeur pour radiosensibiliser les glioblastomes. Outre l’intérêt fondamental que présente la mise en évidence de ces nouvelles voies biologiques conduisant à la radiorésistance tumorale, ces travaux pourront présenter des applications cliniques à moyen terme. En effet, l’équipe pourra concevoir et tester l’effet radiosensibilisant des inhibiteurs des protéines impliquées dans cette voie in vitro (en étudiant la radiorésistance cellulaire de lignées radiorésistantes en présence ou non de cet inhibiteur) puis in vivo (en étudiant la croissance de xénogreffes de ces lignées sur souris immunodéficientes après traitement par cet inhibiteur). Ce type d’étude a déjà été réalisé au laboratoire pour d’autres inhibiteurs en partenariat avec l’industrie pharmaceutique et les résultats obtenus ont permis de mettre en place un protocole clinique actuellement en cours à l’Institut Claudius Regaud.