Les effecteurs des Rho interagissent au niveau des régions switch 1 et 2 mais les acides aminés impliqués dans l’interaction diffèrent de ceux nécessaires pour la liaison des GEFs et des GAPs. Les PRKs (ou PKNs), la Rhoteckine, la Rhophiline possédent un domaine d’interaction avec les Rho, HR1, qui correspond à une leucine « zipper ». ROCK1 et ROCK 2 possèdent un domaine de liaison aux Rho dans leur domaine COOH-terminal. Citron contient également un domaine de liaison aux Rho dans la région C-terminale mais ne présente pas d’homologie avec le domaine des ROCK.
5-1-5-2 Fonctions
Les protéines Rho jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la forme des cellules, de la polarité et de la migration de par leurs effets sur la polymérisation de l’actine, sur la contractilité de l’actomyosine, l’adhérance cellulaire et la dynamique des microtubules. RhoA stimule directement la polymérisation de l’actine via les protéines Dia. Les protéines Dia agissent avec les ROCKs pour induire la formation des fibres de stress (Ridley et al., 2003). La phosphorylation des LIM-kinases contribuent aussi à la formation des fibres de stress d’actine en réponse aux protéines Rho (Riento and Ridley, 2003).
Les microtubules sont essentiels dans la polarité cellulaire et le trafic intracellulaire. L’action commune de ROCK et Dia est essentiel pour la régulation de ces deux mécanismes. En effet ROCK phosphoryle TAU et MAP2 qui sont des protéines qui régulent la stabilité des microtubules(Riento and Ridley, 2003).
La mobilité cellulaire requiert le remodellage de l’adhérance cellule-matrice extracellulaire mais aussi de l’adhérence cellule-cellule. Les protéines Rho joue un rôle essentiel dans la regulation de l’intégrité des ces adhérences (Burridge and Wennerberg, 2004). Par exemple, dans les cellules endothéliales, Rho et ROCKs permettent le désassemblage des
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jonctions intercellules (Riento and Ridley, 2003).Les protéines Rho participent aussi à la formation des zones focales d’adhésion (Ridley et al., 2003).
Les protéines spécifiques de l’adhérance régulent aussi l’activité des protéines Rho. Par exemple, les cadhérines recrutent p190RhoGAP inhibant ainsi l’activité de RhoA lors de la formation des jonctions inter cellules. Les intégrines sont aussi capables de réguler positivement ou négativement l’activité de RhoA(33).
La cytokinèse recquiert la contraction de l’actomyosine. L’inhibition des protéines Rho, des ROCKs ou de la citron kinase cause des défauts de cytokinèse entraînant la formations de cellules géantes multinuclées (Kaibuchi et al., 1999). Dans les cellules de mamifères mDia est localisée au niveau de l’anneau contractile de clivage pendant la cytokinèse.
En plus de leur rôle sur le cytosquelette, les protéines Rho peuvent contrôler la transcription de certains gènes ayant un impact direct ou indirect sur l’organisation du cytosquelette. Par exemple, RhoA active la transcription par le complexe MAL/SRF en altérant le taux d’actine G monomérique induisant la transcription via le facteur de transcription SRF (Serum responsive Factor) de l’actine β, γ, de la vinculine (Miralles et al., 2003).
De plus les protéines Rho ont été largement décrites dans les procéssus de transformation tumorale. RhoA a éte décrite comme surexprimées dans différentes lignées cellulaires présentant un fort pouvoir métastatique ou ayant des défauts de prolifération cellulaire (Ridley, 2004). Des travaux montrent que l’expression de RhoC augmente proportionellement au pouvoir invasif de la tumeur(Ridley, 2004). le rôle de RhoB dans la transformation cellulaire est décrit dans les fonctions de RhoB (voir plus bas).
5-2 RhoB.
5-2-1 Généralités.
RhoB est une protéine de 196 acides aminés présentant 100% d’identité de séquence avec sa protéine homologue chez la souris. RhoA, RhoB et RhoC présentent 90% d’identité de séquence en acides aminés (Aktories and Hall, 1989) (Chardin et al., 1989) (Paterson et al., 1990) (Sekine et al., 1989). Les trois protéines présentent une très forte homologie de séquence dans la région N-terminale, notamment au niveau des domaines Switch 1 et Switch 2 et des domaines de liaison au GTP. C’est la région C-terminale dite région hypervariable, qui contient l’essentiel des différences entre les séquences des trois protéines (Ihara et al., 1998). Cependant RhoB présente certaines caractéristiques biochimiques et biologiques qui la distinguent de ses homologues RhoA et RhoC (Prendergast, 2001) et qui pourraient expliquer certaines de ses fonctions spécifiques dans divers processus cellulaires.
5-2-2-Modifications post-traductionnelles de RhoB.
Contrairement à RhoA et RhoC qui sont exclusivement géranylgéranylées, la protéine RhoB possède une séquence C-terminale de prénylation –CKVL, qui lui permet d’être farnésylée ou géranylgéranylée (Adamson et al., 1992; Baron et al., 2000). RhoB peut être le substrat de la FTase et de la GGTaseI in vitro (Armstrong et al., 1995) comme in vivo (Lebowitz et al., 1997a). D’une manière générale, comme pour les autres protéines de la famille, la prénylation semble indispensable à la localisation cellulaire correcte de la protéine et à la plupart de ses fonctions (Allal et al., 2002; Lebowitz et al., 1997a). Contrairement à RhoA et RhoC, RhoB ne présente pas de domaine polybasique mais elle est palmitoylée sur deux résidus cystéine, juste en amont de la cystéine prénylée (Adamson et al., 1992).
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5-2-3 Localisation cellulaire de la protéine RhoB.
La localisation intracellulaire de RhoB diffère également de celles de RhoA et RhoC. En effet si RhoA et RhoC sont essentiellement localisées au niveau du cytoplasme et de la membrane plasmique, RhoB a été jusqu’alors décrite au niveau des endosomes précoces, de la membrane plasmique, de l’appareil de Golgi (Adamson et al., 1992) (Michaelson et al., 2001).
5-2-4 Induction de l’expression de RhoB.
L’expression de l’ARNm RhoB est régulée au cours du cyle cellulaire. Le taux d’ARNm RhoB augmente lors de la transition G1/S, puis l’expression est maximale au cours de la phase S du cycle (Zalcman et al., 1995). Il a été décrit par ailleurs, que l’expression basale constitutive de RhoB est régulée d’une manière cellule- et tissu-spécifique (Fritz et al., 1999). L’expression de RhoB est inductible par des facteurs de croissance comme l’EGF ou le PDGF (de Cremoux et al., 1994) (Jahner and Hunter, 1991). Malcolm et al. ont montré que l’induction de l’expression de RhoB ne correspond pas à une stimulation de la transcription du gène rhoB, mais est le résultat d’une stabilisation de son ARNm (Malcolm et al., 2003). De plus rhoB est un géne de réponse précoce aux stress génotoxiques tels que les rayonnements UV ou les agents alkylants (Fritz and Kaina, 2001) (Fritz and Kaina, 1997; Fritz et al., 1995). Il a de plus été montré que l’expression protéique de RhoB varie en fonction de la lignée cellulaire et des tissus. En effet l’expression basale est plus importante dans les cellules de rein du singe vert (Cos),d’adenocarcinome du col uterin (HeLa), tumeur primaire hépatique (HepG2) que dans les cellules de fibroblastes murins (NIH3T3), de fibroblastes pulmonaires de hamster chinois (V79), de fibroblastes ovarien de hamster chinois (CHO). Chez le lapin l’expression de RhoB est la plus forte au niveau du poumon par rapport au cœur, au foie aux reins et à la rate (Fritz et al., 1999). Les travaux de
protéasome (Engel et al., 1998). Les travaux de Wang et al. montrent que l’expression de RhoB est également étroitement régulée par les histones déacétylases (HDAC) dans les cellules tumorales pulmonaires (Jiang et al., 2004b; Wang et al., 2003).
5-2-5 Partenaires protéiques de RhoB.
Les voies de transduction du signal impliquant la protéine RhoB sont encore largement méconnues et très peu de partenaires protéiques spécifiques de RhoB ont été identifiés. La très forte homologie entre les protéines RhoA et RhoB explique que de nombreux partenaires décrits de RhoA peuvent également intéragir avec RhoB in vitro. Il apparaît que certaines interactions pourraient participer aux fonctions spécifiques de RhoB. C’est le cas par exemple des protéines PKN/PRK1 et PRK2 initialement décrites comme partenaires de RhoA in vitro qui s’associent à RhoB in vivo au niveau des endosomes et qui sont impliquées dans ses fonctions dans le trafic cellulaire (Mellor et al., 1998). D’autres partenaires spécifiques ont été décrits comme RhoGDI-3 (Zalcman et al., 1996), DB1 (Lebowitz and Prendergast, 1998), p76RBE (Mircescu et al., 2002).
5-2-6 Fonctions biologiques de la protéine RhoB. 5-2-6-2 la protéine RhoB et le trafic endocytaire.
La localisation de la protéine RhoB dans le compartiment endosomal a suggéré son implication dans le trafic endocytaire (Adamson et al., 1992). Gampel et al montrent que la protéine RhoB est activée, via le facteur d’échange Vav2, lorsque le récepteur à l’EGF est internalisé dans les endosomes (Gampel and Mellor, 2002). De plus l’activation de RhoB semble ralentir le trafic intracellulaire du récepteur à l’EGF lorsqu’il est adressé au lysosome(Gampel et al., 1999). De récents travaux montrent un rôle différentiel de RhoB en fonction de l’isoprényl greffé. En effet, les cellules HeLa traitées par le FTI L-744,832 présentent une accumulation de RhoB au niveau
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endosomal alors que dans les cellules non traitées, la protéine RhoB est localisée au niveau de la membrane plasmique et des endosomes. L’accumulation de la protéine sous sa forme géranygéranylée au niveau des endosomes entraîne une rétention du récepteur à l’EGF dans les endosomes tardifs (Wherlock et al., 2004). D’autres travaux montrent l’implication de RhoB dans le trafic endocytaire des protéines kinases PRK1, Src et Akt respectivement (Mellor et al., 1998) (Sandilands et al., 2004) (Adini et al., 2003). L’ensemble de ces travaux montre le rôle de RhoB dans le contrôle du trafic des endosomes.
5-2-6-3 la protéine RhoB et la transformation tumorale.
La protéine RhoB a été largement décrite dans les voies de transformation cellulaire controlées par exemple par la protéine Ras, ErbB2 ou par le récepteur à l’EGFR (Jiang et al., 2004a; Prendergast, 2001) (Prendergast et al., 1995). En effet l’expression ectopique de RhoB dans des cellules NIH3T3 transformées par Ras ou des cellules de cancer du poumon A549 inhibe leur prolifération, leur capacité à former des colonies indépendamment de l’ancrage, l’invasion, la migration et l’apoptose (Jiang et al., 2004a) (Jiang et al., 2004b). Il semblerait que RhoB contrôle la voie Ras/PI3K/Akt, transformante, qui est à l’origine ces mécanismes (Jiang et al., 2004b). De plus dans les cellules murines, le rôle antitransformant de la protéine RhoB semble dépendant de l’isoprénylation. En effet seule la protéine RhoB géranylgéranylée s’oppose à la transformation par Ras dans les cellules NIH3T3 (Mazieres et al., 2005) (Du et al., 1999; Du and Prendergast, 1999; Lebowitz et al., 1997b). De plus la palmitoylation de la cystéine 192 de la protéine RhoB est requise pour son activité antitransformante dans les cellules de cancer prostatique les PC3 (Wang and Sebti, 2005). Dans ces modèles ces modifications post- traductionnelles de RhoB sont donc nécessaires à son activité antitransformante. Il a été récemment montré que les cellules déficientes pour RhoB et transformées par E1A et Ras sont
résistantes à l’apoptose induite par les FTI (Du et al., 1999) (Du and Prendergast, 1999). Kamasani et al. montrent une inhibition de l’expression de la cycline B1 sous traitement FTI dans des cellules MEF alors que les cellules MEF déficientes pour la protéine RhoB, gardent une expression constante de Cycline B1 (Kamasani et al., 2004). Ces résultats montrent un lien entre l’expression de certaines protéines du cycle cellulaire et l’apoptose induite par les FTI au cours de la transformation par Ras et E1A (Kamasani et al., 2003). Confortant ces résultats, divers travaux ont montré une diminution de l’expression de RhoB dans certaines tumeurs ORL (Adnane et al., 2002), du cerveau (Forget et al., 2002), du poumon (Mazieres et al., 2004) suggérant que les cellules tumorales éteignent l’expression de RhoB pour favoriser leur prolifération.
5-2-6-4 la protéine RhoB et la réponse aux stress.
RhoB est une protéine induite de façon précoce en réponse à certains stress cellulaire (Fritz et al., 1995). En effet sa régulation et son rôle on été étudiés en réponse à de nombreux agents induisant des stress cellulaires comme l’hypoxie, les agents chimiothérapeutiques, le rayonnements ultra violets (UV) et les rayonnements γ. Ainsi, de récents travaux menés au laboratoire montrent que dans les cellules de glioblastomes humains U87 placées en conditions hypoxiques, la protéine RhoB est activée et stabilise le facteur de transcription inductible par l’hypoxie HIF-1α en régulant la voie Akt/GSK3 (Skuly, soumis à EMBO J.).
D’autre part de nombreuses études portent sur la régulation du promoteur de RhoB en réponse à certains agents génotoxiques. Il a été montré que la transcription de RhoB est induite par les rayonnements UV mais aussi par un analogue de l’uracile le 5-fluoro uracile (5-FU) qui inhibe la synthèse d’ADN. En réponse aux UV la transcription de l’ARNm de RhoB est induite dans les cellules NIH3T3 (Fritz et al., 1995) et dans les kératynocytes humains (Westmark et al., 2005) (Canghuilem soumis à PNAS). Dans ce modèle l’inhibition de RhoB par la technique
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d’interférence d’ARN induit une augmentation de la mort par apoptose. Par contre, la surexpression de RhoB dans les cellules NIH3T3 renforce l’apoptose induite par le methyl methano sulfonate agent génotoxique (MMS) (Fritz and Kaina, 2000).
En réponse aux RI la protéine RhoB contrôle la régulation de différentes voies radio-induites. Les travaux du laboratoire montrent que l’inhibition de la protéine RhoB par l’utilisation du dominant négatif RhoBN19, dans des cellules HeLa rendues radioresistantes par l’expression du FGF2, radiosensibilise ces cellules. Cette radiosensibilisation est due à une augmentation de la mort post-mitotique (Ader et al., 2002b). D’autre part, dans un modèle de cellules de glioblastomes connus pour leur radioresistance intrinsèque les U87, l’inhibition de RhoB par le dominant négatif radiosensibilise ces cellules (Delmas et al., 2002).
L’ensemble de ces travaux suggérait donc que RhoB est une protéine clef des voies de signalisation contrôlant la réponse au stress et en particulier la réponse aux rayonnements ionisants.
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Notre laboratoire s’intéresse depuis plusieurs années à la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant les voies biologiques régulant la sensibilité des tumeurs à l’irradiation. La thématique de recherche de l’équipe du département Innovation Thérapeutique et Oncologie Moléculaire axé sur l’étude des mécanismes moléculaires controlant la « radiorésistance » des glioblastomes. En effet, malgré un traitement bien conduit associant le plus souvent la chirurgie et la radiothérapie, la survie médiane des patients porteurs de glioblastomes reste voisine d’un an en raison de la faible sensibilité de ces tumeurs aux effets létaux des rayonnements ionisants. Il est maintenant admis que cette diminution de la sensibilité cellulaire à la radiothérapie (que nous appellerons par la suite « radiorésistance ») est en partie due à des modifications d’activité de facteurs intracellulaires contrôlant la survie cellulaire tels que les oncogènes (McKenna et al., 1990), les facteurs de croissance comme le FGF2 (Cohen-Jonathan et al., 1997). Les travaux récents du laboratoire ont démontré que la petite GTPase RhoB était impliquée dans la radiorésistance de cellules de carcinome de col de l’utérus (Ader et al., 2002b) et de cellules de glioblastomes humains (Delmas et al., 2002). En effet, les travaux de l’équipe ont démontré que RhoB était impliqué dans la radiorésistance in vitro (Delmas et al., 2002) et in vivo de la lignée de glioblastome radiorésistante U87 en régulant à la fois la radiorésistance intracellulaire mais aussi le micro-environnement tumoral (Ader et al., 2003).
L’objectif de mon travail de thèse était de décrypter les mécanismes moléculaires contrôlés par RhoB et conduisant à la radiorésistance tumorale. Ce travail devrait permettre de mettre en lumière une nouvelle voie biologique contrôlant la radiorésistance à la fois pour accroître la compréhension de ces mécanismes et surtout identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant la synthèse d’inhibiteurs de ces voies susceptibles d’être des composés qui amplifieraient l’effet létal des rayons sur les tumeurs sans affecter les tissus sains environnants.
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