Les petites GTPases Rho.

5-1 Propriétés générales de la superfamille des petites GTPases Rho.

Les GTPases Rho appartiennent à la superfamille des protéines Ras. La comparaison de l’ensemble des séquences primaires de la superfamille Ras montre qu’elles présentent 30 à 55% d’homologie entre elles (Valencia et al., 1991a). Les protéines Rho peuvent être divisées en six sous familles : « RhoA » (RhoA, RhoB, RhoC) ; « Rac1 » (Rac1 et Rac1b, Rac2, Rac3, RhoG) ; « Cdc42 » (Cdc42 et 25K, TC10, TCL, Chp/Wrch-2, Wrch-1) ; « Rnd » (Rnd1, Rnd2, RhoE/Rnd3) ; RhoBTB ; Miro (Wennerberg and Der, 2004) (Takai et al., 2001).

5-1-1 Structure.

Les protéines Rho présentent 40 à 95% d’homologie entre elles (Valencia et al., 1991a; Valencia et al., 1991b). Chacune possède la séquence caractéristique permettant la liaison au GDP et au GTP et est donc capable de cycler entre un état inactif lié au GDP et un état actif lié au GTP. Ces protéines présentent des modifications post-traductionnelles dont la mieux étudiée est l’isoprénylation protéique (voir § Modifications post-traductionnelles ). L’étude de la structure des protéines Rho a permis de mettre en évidence deux régions essentielles:

• Le domaine catalytique:

Il est formé des 164 premiers acides aminés de la protéine. Il est retrouvé avec plus de 90% d’homologie chez tous les membres de la famille Rho. Il comprend entre autres, le site de liaison aux nucléotides qui forme une poche dans la structure des protéines et est constitué de deux régions flexibles entourant le phosphate g du GTP, la région switch 1 (aa 30-38) et la région

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switch 2 (aa 60-76) responsables de l’interaction avec les effecteurs (Bourne et al., 1991)) (Paduch et al., 2001).

• La région hypervariable :

Elle est formée des 25 acides aminés carboxy-terminaux. L’essentiel des différences de séquence primaire entre les protéines d’une même famille se trouve concentré dans cette région. C’est au niveau de cette région que se font des modifications post-traductionnelles telle que la prénylation, la palmitoylation, la méthylation et la protéolyse (Hancock et al., 1989) (Adamson et al., 1992).

5-1-2 Cycle d’activation/inactivation des petites GTPases Rho.

En accord avec leur structure, les petites protéines G ont deux formes interconvertibles : une forme GDP (Guanosine Di-phosphate) inactive et une forme GTP (Guanosine Tri-phosphate) active (Bourne et al., 1991),(Takai et al., 2001) (fig du cycle GDP/GTP). Un signal en amont stimule la dissociation du GDP, qui est suivi de la liaison du GTP, ce qui entraîne un changement conformationnel du site de liaison aux effecteurs permettant l’interaction avec les protéines effectrices. La forme GTP est convertie en GDP par l’action de l’activité GTPasique intrinsèque de la protéine, permettant ainsi la dissociation de la protéine effectrice.

5-1-3 Régulateurs des GTPases Rho .

Trois types de protéines régulatrices contrôlent le cycle d’activation/inactivation des protéines Rho. Les GEFs (Guanine nucléotide Exchange Factors) stimulent l’échange du GDP par du GTP générant ainsi la forme active de la protéine. Les GAPs (GTPase Activating Protein) stimulent l’activité GTPasique intrinsèque permettant le retour à la forme inactive. Les GDIs (Guanine nucléotide Dissociation Inhibitors) interagissent avec la forme inactive en masquant le prényl

maintenant ainsi la protéine sous sa forme inactive (cf. chapitre modifications post- traductionnelles).

5-1-3-1 Les RhoGEF.

Les RhoGEF, regroupées au sein de la famille Dbl, se caractérisent par la présence d’un domaine d’environ 200 acides aminés, appelé domaine DH (Dbl-homology). Trois régions conservées de 10 à 30 acides aminés (CR1, CR2, CR3) sont indispensables à l’activité d’échange GDP/GTP. Deux de ces domaines, CR1 et CR3 sont exposés à la surface du domaine DH et participent à la formation d’une poche d’interaction. Les régions Switch1 et Switch2 de la Rho GTPase sous sa forme GDP interagissent avec les domaines CR1 et CR3 au niveau de cette poche. La plupart des GEFs possèdent un domaine PH (Plekstrin Homology) en position C-terminale par rapport aux domaine DH qui participerait à la localisation des GEF et à la régulation de leur activité (Rossman et al., 2005). En plus de ces domaines DH et PH, les GEFs présentent d’ autres motifs tels que des domaines fonctionnels comme Ser/Thr/Tyr Kinase, RasGEF et des domaines d’interaction protéine-protéine SH2, SH3, PDZ…(pour revue (Schmidt and Hall, 2002) (Rossman et al., 2005)). La régulation des GEFs se fait par la présence de séquences inhibitrices au sein de la protéine, par des intéractions protéine-proteine et par la localisation subcellulaire.

5-1-3-2 Les RhoGAP.

Les protéines RhoGAP permettent l’activation de l’activité GTPasique intrinsèque des protéines Rho permettant ainsi leur retour à l’état inactif sous forme GDP. Les protéines à activité RhoGAP possèdent toutes un domaine d’environ 150 acides aminés appelé domaine RhoGAP ou domaine BH. Au sein de la famille des RhoGAP, l’identité entre les domaines BH est de 20%. Le domaine RhoGAP interagit avec les régions Switch 1, Switch 2 et le domaine de liaison au GTP

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de la RhoGTPase. Cette famille possède d’autres motifs fonctionnels de type Ser/Thr Kinase, RhoGEF, Arf GAP ainsi que des domaines d’interaction protéine-protéine ou protéine-lipide comme SH2, SH3 PH,(Moon and Zheng, 2003).

5-1-3-3 Les RhoGDI.

RhoGDI est capable d’extraire la RhoGTPase liée au GDP des membranes en se liant à son extrémité C-terminale, masquant ainsi le lipide isoprénique hydrophobe et maintenant la GTPase sous sa forme inactive soluble dans le cytoplasme(Olofsson, 1999). L’activation d’une GTPase par l’action d’une GEF nécessite la dissociation du complexe RhoGDI-GTPaseRho. Trois isoformes de RhoGDI ont été décrites à ce jour :RhoGDI-1, RhoGDI-2, RhoGDI-3 (Zalcman et al., 1996; Zalcman et al., 1999). Ces trois isoformes de RhoGDI présentent une homologie de séquence relativement importante. GDI-1 et GDI-2 présentent 73% d’homologie d’identité sur leur 178 acides aminés. L’identité est de 63% vis à vis de GDI-3 dans cette même région. Les différences de séquence entre les trois isoformes sont localisées dans la région N- terminale. Les trois isoformes présentent divers sites de phosphorylation pour des Ser/Thr kinases (Olofsson, 1999).

5-1-4 Modifications post-traductionnelles.

Les modifications post-traductionnelles des protéines Rho sont nécessaires pour la localisation et les fonctions biologiques de ces protéines. Elles incluent la prénylation, la protéolyse, la carboxyméthylation et la palmitoylation.

5-1-4-1 Mécanismes généraux.

La prénylation protéique est une modification post traductionnelle, irréversible, qui consiste en un greffage covalent, par liaison thioéther, d’un lipide isoprénique, soit un farnésylpyrophosphate, soit un géranylgéranylpyrophosphate, sur une séquence consensus de l’extrémité COOH- terminale de la GTPase. Les protéines Rho présentent à leur extrémité COOH-terminale une boîte consensus de type CAAX (où C est une cystéine, A un acide aminé aliphatique et X un acide aminé quelconque). Trois enzymes différentes sont impliquées dans la prénylation protéique. La farnésyl transférase (FTase) et la géranylgéranyltransférase de type I (GGTase I) reconnaissent les protéines à motif CAAX alors que la géranylgéranyl transférase de type II (GGTase II) reconnaît les motifs XCC ou CXC (Moores et al., 1991) (Reiss et al., 1990) (Yokoyama et al., 1991) (pour revue (Zhang and Casey, 1996)).

Pour les protéines portant le motif CAAX, le choix de l’isoprène est dicté par la nature de l’acide aminé X (Moores et al., 1991). La FTase ajoute un farnesyl lorsque X est une sérine ou une méthionine. La GGTase I ajoute elle un géranylgéranyl lorsque X est une leucine. Après action de ces prényltransférases le tripeptide AAX situé en position COOH terminale est protéolysé en amenant ainsi la cystéine en position C-terminale. Celle-ci devient alors accessible à une carboxyméthyltransférase (Icmt) (Gingras et al., 1993). De nombreuses protéines prénylées telles que RhoB seront ensuite palmitoylées (Hancock et al., 1989). Cette palmitoylation est nécessaire à l’adressage membranaire. Pour certaines protéines telles que Ki-Ras, non palmitoylées, cet adressage est du à un domaine polybasique en amont de la cystéine C-terminale (Cadwallader et al., 1994). L’isoprénylation protéique est nécessaire à l’activité biologique, à l’ancrage membranaire, à l’intéraction protéine/protéine des GTPase Rho.

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5-1-4-2-Inhibiteurs de Farnésyl Transférase (FTI).

La farnésylation de Ras étant nécessaire pour lui conférer son activité transformante (Bernhard et al., 1998), plusieurs laboratoires ont recherché des inhibiteurs de FTase dans le but de développer des traitements antitumoraux ciblant les tumeurs présentant des mutations de Ras. Dans cet objectif, plusieurs stratégies ont été développées et de nombreux composés ont été isolés. La FTase est capable de reconnaître des tétrapeptides de type CAAX et de les farnésyler aussi efficacement que la protéine entière (Reiss et al., 1990). Ainsi, une stratégie visant à produire des inhibiteurs analogues de cette séquence (ou peptidomimétque) a été développée. Par ailleurs, des inhibiteurs compétitif du farnésyl diphosphate, second substrat de la FTase ont également été décrits. Enfin une autre approche a été développée consistant au criblage de composés issus de produits naturels ou de synthèse chimique.

Notre laboratoire s’est intéressé aux effets des FTI sur des lignées cellulaires radiorésistantes ne renfermant pas Ras muté. Les travaux du laboratoire ont montré que le FTI- 277 radiosensibilise des cellules HeLa surexprimant la forme 24kDa du FGF2 avec une induction de la mort post-mitotique (Cohen-Jonathan et al., 1999). Les mêmes études ont été faites sur des lignées de glioblastomes issues de tumeurs radiorésistantes connues pour exprimer le FGF2.

Delmas et al ont ainsi montré que le R-115777 (composé non peptidomimétique)

radiosensibilisait des lignées de glioblastomes humains in vitro ainsi que des xénogreffes de glioblastomes chez la souris nude immunodéficientes (Delmas et al., 2003).

5-1-5 RhoA, RhoB et RhoC : les protéines «Rho ».

5-1-5-1 Structure

Chez l’homme, la souris et le rat, les trois Rho sont retrouvées sur des chromosomes différents (Cannizzaro et al., 1990). Les gène de et RhoC présentent 5 exons alors que le gène de RhoB est très court et n’est composé que d’un exon provenant peut être d’une transcription inverse du gène de RhoA (1).

Les séquences primaires de RhoA, RhoB, RhoC présentent 85% d’identité, les différences majeures se trouvant à l’extrémité COOH-terminale sur la région hypervariable. Les acides aminés essentiels pour la fonction catalytique sont tres conservés dans les trois formes, incluant Gly14, Thr19, Phe30, Gln63 qui sont impliqués dans la liaison à d’autres protéines, la stabilisation de la protéine et l’hydrolyse du GTP (Fig.12). Des différences ayant été observées entre RhoA, RhoB et RhoC au niveau d’une hélice située entre les acides aminés 123 et 137, bien qu’il n’a pas été mis en évidence de partenaires spécifiques de l’une des Rho, intéragissant avec ce domaine il n’est pas exclu qu’il puisse exister des partenaires spécifiques pour chacune d’entre elles intéragissant avec cette hélice.

Quelques différences dans la séquence sont observées entre RhoA, RhoB et RhoC dans la région switch1 suggérant ainsi des regulateurs et des effecteurs différents. Peu de GEFs ou de GAPs ont été testées pour leur activité et leur spécificité sur l’une des trois Rho, l’essentiel des travaux portant sur RhoA. Vav, p115RhoGEF, Bcr et p190 RhoGAP ne presentent pas d’affinité particulière pour RhoA, RhoB ou RhoC par contre GEF XPLN semble interagir spécifiquement avec RhoA et RhoB et non RhoC (Arthur et al., 2002).

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Figure 12: Alignement des séquences d’acides aminés de RhoA, RhoB et RhoC.