De manière intéressante, l’approche APEX2 a permis de mettre en évidence un lien entre RAB21 et les complexes WASH et Rétromère (Article 1, Figure 2C). En effet, le complexe WASH au complet et la protéine CAPZ, impliqués dans la polymérisation d’actine endosomale, sont enrichis seulement avec RAB21. Dans une moindre mesure, le complexe WASH est enrichi avec RAB7 et plus faiblement avec RAB5. Par ailleurs, le CSC (VPS26- 29-35) du Rétromère, SNX27 et SNX3 sont enrichis majoritairement avec RAB7 mais aussi avec RAB5 et RAB21. Enfin, SNX1, 2,5 et 6 sont enrichis avec RAB21 et RAB5 et non avec RAB7. RAB5 et RAB7 ont tous deux étés impliqués dans la régulation et le recrutement du Rétromère aux endosomes précoces (Rojas et al. 2008; Priya et al. 2015). Ces données suggèrent que RAB7 serait impliquée dans les fonctions du Rétromère liées à SNX27 et SNX3. Au contraire, RAB5 et RAB21 réguleraient potentiellement les fonctions du Rétromère liées à SNX1/2 et 5/6. Ces données pourraient expliquer comment le Rétromère est impliqué dans des triages de cargos spécifiques depuis l’endosome précoce vers différentes destinations. De la même manière, le complexe WASH interagit majoritairement
régulation d’un même mécanisme (Jean and Kiger 2012). Il est donc possible que RAB21 recrute le complexe WASH au Rétromère suite au recrutement de ce dernier par RAB5 et/ou RAB7. De plus, l’analyse de données bio-informatiques montrent que RAB7 et RAB21 coopèrent dans la régulation du complexe WASH et du complexe CCC qui possède des fonctions équivalentes au Rétromère (Clague and Urbé 2020). L’immunoprécipitation de protéines biotinylées dans les lignées APEX2:RAB21, APEX2RAB5 et APEX2:RAB4 confirme que le complexe WASH (Strumpelline) est majoritairement enrichi avec RAB21 et que le Rétromère (VPS35) l’est avec RAB5 (Article 1, Figure 3A). Les interactions entre RAB21 et les complexes WASH et Rétromère ont été confirmées par des approches de co- immunuoprécipitation, de purification GST et de colocalisation par immunofluorescence (Article 1, Figure 3A, B, C, D et E). Ces expériences confirment l’interaction entre RAB21 et le Rétromère ainsi qu’entre RAB21 et le complexe WASH. Cependant, elles ne permettent pas de définir la nature directe de ces interactions. FAM21, Strumpelline, et VPS35 interagissent majoritairement avec les formes sauvage et constitutivement active de RAB21 et aussi, mais en moindre mesure, avec le dominant négatif de RAB21. Le complexe WASH et le Rétromère ne peuvent donc pas être considérés comme des effecteurs de RAB21 à part entière, selon les définitions actuelles. Cependant, il a été montré que RAB11 interagit avec des effecteurs sous sa forme liée au GDP (Pylypenko et al. 2018). De plus, les dernières études de BioID montrent que les dominants négatifs de RAB11 et de RAB5 interagissent avec des effecteurs potentiels et pas uniquement avec des GEF et des GDI (Gillingham et al. 2019). Ces résultats amènent une nouvelle question, à savoir comment définir les effecteurs et l’activité potentielle des RAB sous leurs formes liées au GDP ou au GTP. En effet, le changement de conformation induit par l’échange du GTP en GDP peut déstabiliser et non inhiber complètement l’interaction entre une RAB et ses effecteurs (Pylypenko et al. 2018).
De la même manière, certaines RAB subissent des changements de conformation plus ou moins drastiques pouvant expliquer que certaines interactions perdurent malgré l’échange de GTP par le GDP. De plus, il est possible que ce changement de conformation induise l’interaction avec de nouveaux effecteurs et pas seulement avec des GAPs et des GDI.
Par ailleurs, RAB21 colocalise fortement avec FAM21 et VPS26 et en moindre mesure avec WASH (Article 1, Figure 3E). Il est donc possible que RAB21 recrute le complexe WASH au Rétromère via l’interaction avec FAM21 qui fait partie du complexe WASH et interagit avec VPS35. De la même manière, FAM21 permet le recrutement de CAPZ (Park et al. 2013). Aussi, il est possible que RAB21 soit impliquée dans l’assemblage du complexe WASH à l’endosome. La déplétion de RAB21 par l’approche CRISPR/Cas9 affecte les niveaux d’expression des membres du CSC mais pas ceux des membres du complexe WASH (Article 1, Figures 5A, B, et C). Or, les niveaux d’expression des membres du complexe WASH sont interdépendants. Il est donc peu probable que RAB21 soit impliquée dans l’assemblage du complexe WASH. De plus, la déplétion de RAB21 n’affecte que partiellement le recrutement du complexe WASH aux endosomes précoces (Article 1, Figures 5F, G et H). Il est possible qu’en l’absence de RAB21, le complexe WASH soit recruté par la sous-population du complexe du Rétromère toujours présente aux endosomes précoces ainsi que la protéine HRS. Par ailleurs, le rôle de RAB21 dans le recrutement du complexe WASH pourrait être compenser par d’autres RAB endosomales. En revanche, la déplétion de RAB21 inhibe fortement les niveaux de polymérisation de F-actine aux endosomes précoces (Article 1, Figures 5I et J). RAB21 est donc essentielle à l’activité endosomale de WASH plus qu’à son recrutement.
La délétion de RAB21 semble affecter le recrutement du CSC aux endosomes précoces (Article 1, Figure 5C, D, et E). Cependant, il est difficile de discriminer les défauts de localisation aux endosomes précoces des défauts d’expression du Rétromère. Au contraire, la déplétion de RAB21 n’affecte pas les niveaux d’expression de SNX1 mais inhibe partiellement son recrutement aux endosomes précoces (Article 1, Figure EV5 A, B et C). Le maintien du recrutement du Rétromère et du complexe WASH aux endosomes précoces, et ce en absence de RAB21, peut être expliqué par l’activité de RAB7 et de SNX3. De même, la protéine HRS associée à la dégradation lysosomale médie le recrutement de WASH aux endosomes précoces (MacDonald et al. 2018). Il est donc possible que RAB21 ne soit pas impliquée dans le recrutement du complexe WASH aux endosomes précoces mais plus spécifiquement dans la coordination de l’activité de WASH et des complexes de sélection des cargos. En effet, il a déjà été montré que RAB5 et RAB7 agissent successivement pour coordonner l’activité des SNX1/2-5/6 et du CSC du Rétromère (Rojas et al. 2008). RAB21 pourrait agir dans la continuité de cette cascade afin de médier l’activité de WASH. Aussi, il est possible que RAB21 soit impliquée dans le recrutement d’une sous-population de WASH et du Rétromère. En effet, la déplétion de RAB21 semble impliquée dans le recyclage à la membrane plasmique d’une sous-catégorie de cargos, dits clathrine-indépendants.
La délétion de RAB21 affecte le recyclage à la membrane plasmique via la formation de tubules de recyclage des cargos SLC3A2, CD44, et de la Basigin (Article 1, Figures 6G et H). Il est intéressant de noter que SLC3A2 et Basigin ont été identifiés comme des cargos potentiels de RAB21 via l’approche AP-MS (Article 1, Figure EV1F). Au contraire, la déplétion de RAB21 n’affecte pas le transport rétrograde au réseau transgolgien des cargos CI-MPR et GLUT1 (Article 1, Figure 6A et B). De plus, l’absence de RAB21 induit la dégradation lysosomale de SLC3A2 (Article 1, Figures EV5F, G, H et I). Il est à noter que
des défauts de recyclage de cargos sont régulièrement associés à leur dégradation. Ici, la déplétion de RAB21 semble donc orienter le trafic des cargos vers la dégradation. Cela peut être un effet direct de l’inhibition de l’activité de WASH. En effet, la polymérisation d’actine aux endosomes précoces est essentielle à la formation de tubules mais permet aussi d’inhiber la voie de dégradation en générant des frontières d’actine qui délimitent physiquement des régions de recyclage. De plus, le Rétromère inhibe la voie de dégradation par le recrutement de TBC1D5 et RME-8 qui inhibent respectivement RAB7 et ESCRT (Seaman et al. 2009; Norris et al. 2017).
Une autre possibilité expliquant les défauts de polymérisation d’actine serait que RAB21 régule plus directement l’activité de WASH. En effet, le complexe WASH est activé par l’ubiquitination de WASH1 par l’ubiquitine ligase TRIM27, ou l’un des partenaires potentiels spécifiquement enrichi avec RAB21 par l’approche APEX2 est USP7 qui déubiquitine WASH1 (Article 1, FigureEV4B). Il a été montré que le cycle d’ubiquitination et de déubiquitination de WASH était essentiel dans l’induction de la polymérisation d’actine. De plus, TRIM33, une ubiquitine ligase, est spécifiquement enrichie avec RAB21. Il n’est donc pas impossible que RAB21 régule l’activité du complexe WASH en induisant son ubiquitinylation via le recrutement d’ubiquitines ligases autres que TRIM27.
Enfin, les données des analyses d’APEX2:RAB21 montrent des enrichissements spécifiques de C16orf62 membre du complexe Retriever, et de certains membre du complexe CCC. Des études d’analyses bioninformatiques confirment le rôle de RAB21 dans la régulation de l’activité du complexe CCC(Clague et Urbé 2020). En effet, dans cette étude, il a été montré par l’analyse de cribles CRISPR/Cas9 que RAB21 et les membres COMMD2, 6, et 8 du complexe CCC sont co-dépendants. Par ailleurs, le complexe CCC qui est lié au
recrutement de la phosphatase MTMR2 (Singla et al. 2019). En revanche, la déplétion de RAB21 semble favoriser le recrutement de C16orf62 aux endosomes précoces. De plus, MTMR13 qui interagit directement avec MTMR2 est une GEF de RAB21. Enfin, les derniers résultats du laboratoire semblent montrer que la déplétion de RAB21 induit une baisse de l’accumulation du PI(3)P aux endosomes précoces. RAB21 et le complexe CCC semblent avoir des fonctions antinomiques. Ici, RAB21 semble donc moduler la balance entre le Rétromère et le Retriever afin d’influencer le type de cargos sélectionnés.
La GEF VARP et la GAP TBC1D5 lient toutes les deux le même domaine de VPS29 et il a été montré que la déplétion de VARP inhibe le recyclage de MCT-1. Confirmant les données de la littérature, VARP est exclusivement enrichie avec RAB21 (Article 1, Figure 2C). De la même manière, la déplétion de RAB21 inhibe fortement la présence de MCT-1 à la membrane plasmique (Article 1, Figures 6D et E). Il est donc fort probable que RAB21 soit associée au Rétromère en présence de VARP régulant ainsi le recyclage à la membrane d’une sous-catégorie de cargos clathrine-indépendants. L’ensemble des résultats décrits dans cette études sont des observations et il sera nécessaire de réaliser d’autres études afin de décrire les mécanismes moléculaires de régulation de l’activité des complexes WASH et Rétromère par RAB21. Aussi, de plus amples études permettront de définir comment RAB5, 7 et 21 sont coordonnées afin de réguler ces complexes. Cependant, il est très intéressant de noter que la simple comparaison des différences d’enrichissements protéiques avec chacune des RAB permet de suggérer l’implication et la coordination des RAB5, 7 et 21 dans la régulation des processus de triage dépendants du Rétromère.