L’interaction des effecteurs avec les RAB est régulée par les changements de conformation suite à l’échange du GTP en GDP ainsi que par leur localisation (Pylypenko et al. 2018). Les approches développées, à ce jour, consistent à identifier les effecteurs et les GAP des RAB en caractérisant les partenaires protéiques des formes constitutivement actives des RAB. De même, les GEF ont été étudiées par l’étude des partenaires de la forme inactive des RAB. Ainsi, les études des RAB nécessitent l’expression des mutants Q-L, constitutivement actifs, et des mutants S-N, dominants négatifs (Gillingham et al. 2014).
Une première approche consiste à identifier par spectrométrie de masse l’ensemble des effecteurs des RAB et ce, suite à des purifications par affinité via l’utilisation de colonnes GST (Gillingham et al. 2014). Cependant, les conditions de purifications, la difficulté à charger le GTP sur les RAB in vitro, ainsi que l’absence de contexte cellulaire ne permettent pas d’obtenir une vue d’ensemble des partenaires des RAB. Dernièrement, le développement de nouvelles approches de protéomique de marquage par proximité a offert de nouvelles possibilités. En effet, les approches BioID et APEX2 permettent de biotinyler in cellulo l’ensemble de l’environnement protéique d’une protéine d’intérêt, de purifier et de caractériser ces protéines par spectrométrie de masse (Roux et al. 2012; Lam et al. 2014). Aussi, l’approche BioID a été récemment utilisée pour l’étude des RAB (Gillingham et al. 2019). Dans cette étude, les mutants Q-L et S-N ont été exprimées et relocalisées à la mitochondrie. Cette approche a permis d’identifier de nombreux effecteurs dans un contexte cellulaire. En revanche, l’utilisation de mutants et la relocalisation à la mitochondrie ne permet pas de rendre compte de la localisation endogène ni des variations attribuables aux changements de conformation des RAB. Enfin, ces approches ne permettent pas d’identifier des partenaires qui nécessitent la présence de plusieurs déterminants tels que des phospholipides (Jean et Kiger 2012).
Pour pallier ces limitations, nous avons choisi d’utiliser l’approche APEX2 avec la forme sauvage de RAB21. Afin de valider l’approche, nous avons comparé les résultats obtenus avec deux autres RAB localisées aux endosomes précoces, RAB4 et RAB5 et une RAB associée aux endosomes tardifs, RAB7 (Hutagalung et Novick 2011). Tout d’abord, nous avons validé que l’induction de la biotinylation de chacune des RAB fusionnées à l’enzyme APEX2 soit bien sous le contrôle de l’ajout de H2O2 (Article 1, Figure 1C).
APEX2:RAB4, 5 et 21 (Article 1, Figure 1D) et aux lysosomes pour APEX2:RAB7 (Article 1, Figure EV3E). Ces résultats suggèrent que la fusion des RAB avec APEX2 ne semble ni affecter l’activité d’APEX2, ni affecter la localisation des RAB. De plus, si l’on s’attarde sur la biotinylation induite par la protéine de fusion APEX2:RAB21, on constate un marquage présent sur des structures semblables au RE et, plus faiblement, diffus dans le cytosol (Article 1, Figure 1D). Cette biotinylation peut s’expliquer par le fait que RAB21 n’est pas seulement localisée aux endosomes précoces mais a aussi été identifiée au RE et au Golgi, dans certains contextes. En revanche, le marquage cytosolique observé peut être associé à une sous- population de RAB21 qui est sous sa forme inactive et donc solubilisée dans le cytosol via son interaction avec une GDI. Étant donné le contexte où APEX2:RAB21 est surexprimée, nous ne pouvons pas exclure qu’une partie du marquage observé soit la résultante d’une expression ectopique. Cependant, l’induction de biotinylation cytosolique ou réticulaire n’est pas observée avec la protéine de fusion APEX2:RAB7 (Article 1, Figure EV3E). Cela suggère que le marquage cytosolique est dépendant de la RAB et non de la fusion avec APEX2.
Par ailleurs, les derniers résultats non publiés du laboratoire semblent démontrer que l’approche APEX2 est applicable à la plupart des RAB. En effet, cette approche s’est montrée efficace avec les RAB 1A, 2A, 3A, 4B, 5B, 6, 9, 11A, 18, 22A, 23, 25, 27A, 30, 32, 33B, et 35. La comparaison des protéines enrichies avec chacune des RAB montre que les RAB21, 5A et 4 forment une sous-classe. RAB7 semble être isolée. De même, RAB33 et RAB2 forme une autre sous-classe au sein des RAB. L’ensemble de ces résultats est cohérent avec les données de la littérature, et valide l’approche utilisée. De plus, les voies de signalisation associées au protéines enrichies avec chacune des RAB4, 5, 7 et 21 semblent cohérentes avec les fonctions attendues (Article 1, Figure 2B).
Lorsque l’on compare les enrichissements relatifs des protéines avec chacune des RAB (Figure 2A et EV3D), on observe que RAB21 est très proche de RAB5, plus éloignée de RAB4 et très différente de RAB7. Ces résultats suggèrent que RAB5 et RAB21 possèdent des fonctions similaires et potentiellement redondantes. Cela confirme certaines données de la littérature. En effet, RAB5 et 21 sont toutes les deux associées aux endosomes précoces et régulent l’internalisation des intégrines (G. Stupack and A. Torres 2012; Pellinen et al. 2006). La forte homologie entre RAB5 et RAB21 peut expliquer ces ressemblances. Malgré des similarités, il est possible de noter des spécificités avec chacune des RAB. En effet, le complexe EARP, effecteur nouvellement identifié pour RAB4, est identifié au complet et spécifique à RAB4 (Article 1, Figure 2C). Par ailleurs, le Rétromère est fortement enrichi avec RAB7 (Article 1, Figure2C). Enfin, SLC7A11, PDS5A, PIKFYVE, PIK3R2 et d’autres protéines sont enrichies uniquement avec RAB21 (Article 1, Figure EV4A et B). Ces différences observées confirment la notion de microdomaines générés par les RAB, et valident des spécificités fonctionnelles entre RAB5 et RAB21.
L’enzyme APEX2 permet de biotinyler l’environnement protéique mais ne permet pas de dissocier les interacteurs directs des protéines présentes dans l’environnement proche des RAB. Cela mène donc à l’identification d’un grand nombre de protéines. En effet, plus de 1300 protéines sont enrichies en combinant les quatre RAB. Il apparait évident que ces 1300 protéines ne sont pas des partenaires directs. Plus de mille protéines ont été identifiées avec RAB21 et 62 avec RAB7 (Article 1, Figure 2A). Cette différence peut s’expliquer par une densité accrue de cargos et d’effecteurs à la surface des endosomes précoces vis-à-vis de celles des lysosomes. Aussi, la localisation de RAB21 semble associée à divers compartiment, contrairement à RAB7 qui apparait restreint aux vésicules lysosomales. Il est
ainsi que des différences de disponibilité en biotin-phénol entre les lysosomes et les endosomes précoces peuvent expliquer les différences de niveaux de biotinylation. L’identification de plus de 1000 partenaires potentiels ne permet pas, en soi, d’identifier les effecteurs et régulateurs spécifiques de chaque RAB. En revanche, lorsque l’on compare les enrichissements relatifs à chacune des RAB, il apparait de fortes spécificités.
Une autre méthode pour pallier ce problème consiste à combiner les résultats de l’approche APEX2 avec ceux de l’approche de protéomique quantitative SILAC, combinée à la purification par affinité, appliquée aux protéines de fusion GFP:RAB21-WT, au dominant négatif GFP:RAB21-T33N et au constitutivement actif GFP:RAB21-Q78L. Comme attendu, les protéines de fusion GFP:RAB21-WT et GFP:RAB21-Q78L sont essentiellement localisées aux endosomes précoces et GFP:RAB21-T33N au Golgi (Article 1, Figure EV1 A,B,C et D). Lorsque l’on compare les 272 protéines enrichies dans la lignée HeLa et les 175 dans la lignée HCT116 (Article 1, Figure EV2A et B), on note des spécificités liées au type cellulaire. De plus, l’analyse des voies de signalisations enrichies montre qu’elles sont majoritairement liées à la traduction dans la lignée HeLa et aux mitochondries dans la lignée HCT116 (Article 1, Figure EV2D et E). Ces résultats sont éloignés des données de la littérature et des résultats obtenus avec l’approche APEX2. Ce n’est que lorsque l’on considère uniquement les protéines enrichies dans les deux lignées que l’on obtient un réseau de 29 protéines associées à des fonctions liées au trafic membranaire (Article 1, Figure EV2E, F, et G). Les protéines identifiées semblent préférentiellement interagir avec la forme active de RAB21 (Article 1, Figure EV2C). Comparativement à l’approche APEX2, l’utilisation des protéines de fusion GFP:RAB21 nécessite la combinaison de multiples conditions afin d’obtenir des résultats cohérents. De plus, il semble qu’un grand nombre de partenaires soient perdus lors de la purification. Cependant, l’utilisation de l’approche APEX2 est limitée par
la présence de tyrosines accessibles afin d’être biotinylées. En effet, l’ensemble des cargos et effecteurs transmembranaires avec un domaine cytosolique ne présentant pas de tyrosine ne seront pas identifiés. Ici, l’approche de purification par affinité en contexte SILAC présente un avantage et permet l’identification de partenaires potentiels tels que TMED10, SLC3A2 et Basiginin (Article 1, Figure EV1F). Ainsi, la combinaison des deux approches semble complémentaire et permit l’identification de nombreux cargos, effecteurs et régulateurs potentiels de RAB21 et ce, contrairement aux études réalisées précédemment.