3. L’interaction XPC/centrine 2
3.3. Rôle de l’interaction XPC/centrine 2 ?
3.3.1.
Etude chez S.cerevisiae
Cdc31p interagit directement avec rad4 mais pas avec rad23 (Chen et Madura, 2008). Un mutant ∆cdc31p est sensible aux UVC et l’expression de cdc31p dans ces mutants restaure la résistance à ces rayonnements. Cdc31p interagirait avec un complexe pré-assemblé rad4/rad23, et cette interaction serait constante tout au long du cycle cellulaire. Les auteurs suggèrent que Cdc31p pourrait promouvoir la réponse cellulaire aux dommages de l’ADN en régulant la progression du cycle cellulaire.
Chez la levure S.cerevisiae, il existe un nouveau facteur impliqué dans le NER appelé Rad33 (Dulk et al, 2006). Les cellules ∆rad33 sont modérément sensibles aux UV et présentent une activité de NER réduite. Elles ont un niveau réduit de rad4, comme c’est le cas dans les cellules ∆rad23. Les cellules ∆rad23∆rad33 sont hypersensibles aux UV mais le niveau de rad4 n’est pas plus réduit que dans les cellules simples ∆rad23 ou ∆rad33. Ceci suggère que rad33 a un rôle additionnel dans la réponse aux UV. Rad33 lie directement rad4 mais pas rad23 (Dulk et al, 2008). Il n’existe pas de séquence homologue à rad33 chez l’homme. Mais rad33 a une structure proche de cdc31p et lie rad4 par la triade WLL impliquée dans l’interaction avec cdc31. De plus, le rôle de rad33 dans le NER est dépendant de son interaction avec rad4. Les auteurs suggèrent que le rôle de rad33 dans le complexe rad4/rad23 est similaire à celui de la centrine 2 dans le complexe XPC/Rad23B.
3.3.2.
Etude chez A.thaliana
Le criblage génétique de lignées d’Arabidopsis thaliana présentant une forte activité de recombinaison homologue a été réalisé pour étudier ces mutants hyperrecombinants et une
possible balance entre voies de réparation de l’ADN. Il a ainsi été isolé un mutant présentant un défaut d’expression du gène codant pour la centrine 2 de cette espèce appelée AtCen2 (Molinier et al, 2004 ; Liang et al, 2006). La protéine AtCen2 présente 49% d’homologie avec la centrine 2 humaine et plus de 70% d’homologies dans les domaines EF. Le mutant est sensible aux UVC et il a une activité de réparation in vitro réduite, suggérant un lien direct entre le défaut d’expression d’AtCen2 et la diminution de l’activité du NER. Le taux d’expression d’AtCen2 est induit dès 30 minutes après une irradiation aux UVC dans des plantes sauvages et demeure stable au moins 6 heures après, impliquant AtCen2 dans un rôle précoce du NER. En outre, AtCen2 interagit directement avec AtRad4, par sa partie C- terminale et de façon dépendante du Ca2+. Ce domaine est d’ailleurs suffisant pour stimuler le NER in vitro en association avec AtRad4.
Chez la levure et les mammifères, la réparation des crosslinks fait intervenir le NER et la RH (McHugh et al, 2001). Chez A.thalianas, un traitement au cisplatine induit également ces deux voies de réparation, et la surexpression d’AtCen2 abolit l’augmentation de la fréquence de RH. L’augmentation de la réparation via le NER peut donc inhiber la RH. Il pourrait ainsi exister un mécanisme de balance entre deux voies de réparation de l’ADN chez cette espèce de végétaux.
3.3.3.
Etude chez l’homme
Une étude a été réalisée pour déterminer l’impact sur le NER des modifications des 3 acides aminés de XPC prédits pour être impliqués dans l’interaction avec la centrine 2 in vitro (Nishi et al, 2005). Dans les fibroblastes de patients XP-C complémentés étudiés, 5% de Rad23B et 10% de la centrine 2 sont liées à XPC. Cette stœchiométrie reste constante après une irradiation aux UVC. L’utilisation de protéines XPC tronquées a confirmé les observations structurales : la région en hélice α’N847-R866 est bien nécessaire à la liaison à la
centrine 2. Un peptide GST-XPC (847-866) est ainsi suffisant pour co-précipiter la centrine 2 alors que ce même peptide modifié pour les 3 acides aminés WLL appelé 3A(WLL) ne la co- précipite plus.
Une cinétique de réparation des 6,4-PP a été établie dans des fibroblastes transfectés de façon stable avec un FLAG-XPC normal ou modifié. 5 heures après une irradiation aux UVC à 10 J/m², il restait encore la totalité des 6,4-PP dans les fibroblastes non transfectés. Les fibroblastes exprimant le FLAG sauvage ont éliminé 90% et 99% des lésions 3 et 5
heures après irradiation, respectivement. Les cellules exprimant le FLAG-XPC(3A(WLL)) entraînent la réparation de 53% et 73% des lésions aux mêmes temps. Une interaction correcte entre XPC et la centrine 2 peut donc stimuler l’efficacité du NER, bien qu’elle ne soit pas essentielle à la réparation.
Des expériences de gel retard ont permis de confirmer que la centrine 2 permettait d’amplifier directement la liaison du complexe XPC/Rad23B sur l’ADN endommagé in vitro. En absence de centrine 2, le complexe XPC/Rad23B ou le variant 3A(WLL) présentent la même affinité pour les 6,4-PP. L’ajout d’une quantité croissante de centrine 2 induit une stimulation progressive (jusqu’à 20 fois) de la liaison du complexe sauvage à l’ADN endommagé, alors qu’il n’a aucun effet sur l’affinité du complexe muté envers la lésion. Il est intéressant de noter que la centrine 2 augmente de 4 fois l’activité de liaison du complexe sauvage à l’ADN non endommagé.
La centrine 2 n’est pas essentielle au NER in vitro (Araki et al, 2001), mais elle semble jouer un rôle important dans la stimulation de cette voie de réparation en augmentant l’affinité du complexe XPC/Rad23B à l’ADN endommagé par une interaction directe avec XPC. Le rôle de l’interaction entre XPC et la centrine 2 dans le NER est moins évident in vivo. Nishi et al. évoquent la possibilité que la centrine 2 pourrait faire le lien entre la réparation de l’ADN et la division cellulaire, et régulerait ainsi la réponse cellulaire aux dommages de l’ADN.
Objectifs de la thèse
L’objectif de ma thèse était d’étudier l’implication des protéines XPC, Rad23B et centrine 2 dans la réponse cellulaire aux UV.
Nous avons tout d’abord caractérisé plus précisément l’interaction entre XPC et la centrine 2 au niveau moléculaire et cellulaire. Nous avons ensuite déterminé l’impact de la réduction ou de l’absence de XPC sur le niveau basal et la distribution subcellulaire de la centrine 2.
Nous avons analysé la sensibilité à différents agents génotoxiques et l’efficacité de réparation d’un ADN viral irradié aux UVC de cellules présentant une réduction stable de l’expression de XPC, Rad23A et/ou Rad23B.
Nous avons également développé un outil de microirradiation laser couplée à l’imagerie confocale in vivo qui nous a permis d’étudier le recrutement de XPC sur des zones nucléaires endommagées dans différentes conditions.
Enfin, nous nous sommes intéressés au rôle éventuel de XPC dans l’induction de l’expression de ses partenaires après la reconnaissance des lésions de l’ADN.