Les protéines Rad23 dans l’initiation du GG-NER et la voie de l’ubiquitine

La famille Rad23 comporte entre autres la protéine rad23 de levure et les deux homologues de mammifères Rad23A et Rad23B. Elles participent au GG-NER en en stabilisant rad4 (levure) ou son orthologue XPC (mammifère). Les protéines Rad23 interagissent avec le protéasome et avec des protéines conjuguées à l’ubiquitine, ce qui suggère un rôle dans la régulation de la dégradation des protéines. Chez l’homme (Figure 8), la protéine Rad23B possède un domaine N-terminal ressemblant à l’ubiquitine (ubiquitin-like domain, « Ubl ») et deux domaines associés à l’ubiquitine (ubiquitin-associated domain, « UBA »). Rad23B interagit avec XPC par un domaine situé dans sa partie C-terminale. Son domaine Ubl interagit avec le complexe 19S du protéasome 26S alors que les domaines UBA peuvent se lier aux chaînes polyubiquitinées.

Figure 8 Les domaines caractéristiques de Rad23B humain. La protéine possède un domaine N-terminal ressemblant à l’ubiquitine (Ubl), un domaine central et un domaine C- terminal associés à l’ubiquitine (UBA1 et 2). Rad23B interagit avec XPC par sa partie C- terminale, entre les deux domaines UBA. D’après G.Craescu.

1.5.1.

Rôles de la protéine rad23 chez la levure S.cerevisiae

Rad23 forme un complexe avec rad4 appelé NEF-2 (Nucleotide Excision Repair Factor 2). Ce complexe lie préférentiellement l’ADN endommagé et est nécessaire à son incision, mais ne possède pas d’activité catalytique (Guzder et al, 1998 ; Jansen et al, 1998). Ceci suggère que NEF-2 aurait un rôle dans une étape précoce du GG-NER, en reconnaissant les dommages.

Rad23 interagit avec rad4 et le protéasome par ses parties C-terminale et N- terminale, respectivement (Schauber et al, 1998). L’interaction entre rad4 et rad23 entraîne

Ubl

Rad23B

Ubl Ubl

l’ubiquitylation et la stabilisation de rad4, mais l’interaction entre rad23 et le protéasome est également requise pour le NER (Ortolan et al, 2004). Ces auteurs suggèrent qu’après la réparation de l’ADN certaines protéines doivent être dégradées, évoquant ainsi un nouveau mode de régulation d’une voie de réparation de l’ADN. En effet, rad4 est dégradée par le protéasome 26S, l’activité du NER augmentant chez des mutants défectueux pour l’activité protéasomale (Lommel et al, 2000 ; Lommel et al, 2002). Rad23 pourrait ainsi jouer deux rôles concurrents lors du NER. Toutefois, l’interaction entre rad23 et le protéasome n’apparaît pas reliée à la stabilité de rad4. Rad23 peut donc stimuler la liaison de rad4 sur l’ADN endommagé, et stabiliser le niveau de rad4 (Ramsey et al, 2004 ; Xie et al, 2004).

Le complexe NEF-2 interagit également avec Snf5 et 6, deux sous-unités du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF (Gong et al, 2006). Cette interaction est stimulée par les UV. Le NER et le réarrangement des nucléosomes sont réduits quand le complexe SWI/SNF est inactivé. Ces résultats indiquent que le complexe SWI/SNF pourrait être recruté au niveau des lésions par le complexe rad4/rad23 afin d’augmenter l’accessibilité à la chromatine des autres facteurs du NER.

De nombreux régulateurs du cycle cellulaire sont dégradés par la voie de l’ubiquitine- protéasome (Reed, 2003). Des protéines contenant des domaines UBL-UBA telles que rad23 ou dsk2 sont ainsi essentielles à la progression du cycle cellulaire (Biggins et al, 1996 ; Diaz- Martinez et al, 2006). La protéine rad23, en plus de sa fonction lors de l’initiation du GG- NER, pourrait donc réguler d’autres voies métaboliques.

1.5.2.

Rôles des protéines Rad23A&B chez les mammifères

Chez les mammifères, il existe deux homologues de rad23 appelés Rad23A et Rad23B. Un complexe XPC/Rad23B a été purifié à partir de cellules HeLa (Masutani et al, 1994). Rad23B n’est pas essentiel au GG-NER in vitro mais il peut le stimuler en présence de XPC (Sugasawa et al, 1996). Cette stimulation dépend d’ailleurs de la région de Rad23B impliquée dans l’interaction avec XPC (Masutani et al, 1997). Dans un système de réparation reconstitué à l’aide de protéines ou de complexes purifiés, Rad23B multiplie par 10 l’activité de liaison à l’ADN de XPC, et le complexe XPC/Rad23B a une affinité 400 fois plus élevée pour l’ADN endommagé (Batty et al, 2000). Il a été montré que XPC interagissait in vivo avec Rad23B, et des cellules déficientes en XPC transfectées avec une protéine délétée de son domaine d’interaction avec Rad23B ne peuvent pas être complémentées (Li et al, 1997). Mais

Rad23B n’étant pas absolument requis pour le GG-NER, les auteurs évoquent la possibilité que la région de XPC délétée puisse être impliquée dans d’autres fonctions.

Rad23A peut également stimuler le GG-NER in vitro ce qui suggère que ces deux protéines sont fonctionnellement redondantes, au moins pour la réaction du GG-NER (Sugasawa et al, 1997). Ces résultats ont été confirmés in vivo chez la souris où les deux protéines sont appelées mRad23A et mRad23B. Mais chez l’homme, des études récentes montrent en fait que ces deux protéines auraient des rôles distincts aussi bien lors du GG-NER que dans la dégradation des protéines.

1.5.2.1. Les protéines mRad23A et mRad23B ont des fonctions redondantes ? Des fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs, « Mouse Embryonic Fibroblasts ») mRad23B-/- sont peu sensibles aux UV et présentent un taux de réparation de l’ADN normal, ce qui indique que mRad23A a compensé la fonction de mRad23B dans le GG-NER (Ng et al, 2002). Mais les embryons mRad23B-/- montrent de graves problèmes de développement et un taux élevé de mort intra-utérine, suggérant un rôle unique de mRad23B dans le développement. Deux études ont ensuite été réalisées sur des MEFs simples ou doubles Knock-Out (KO) (Ng et al, 2003 ; Okuda et al, 2004). Des MEFs mRad23A-/- et mRad23B-/- ont une activité de GG-NER normale alors que des MEFs double-KO mRad23A-/- _mRad23B-/- (appelés DKO) ont une activité très réduite similaire à celle de MEFs XPC-/-, confirmant un certain chevauchement fonctionnel des deux protéines lors du GG-NER. Elles protégeraient en fait XPC de la dégradation protéasomale : en absence des protéines mRad23, la protéine XPC est instable et faiblement détectable, empêchant l’initiation du GG-NER. L’expression de mRad23A dans des MEFs DKO restaure d’ailleurs le niveau basal et la stabilité de XPC mais aussi l’activité de réparation de ces fibroblastes. Les auteurs suggèrent qu’une partie de mRad23B est complexée à XPC et contrôlerait sa protéolyse pour maintenir son niveau d’expression à un taux basal optimal (Figure 9). Après une irradiation, il y a une augmentation de l’expression de XPC qui est stabilisée par son interaction avec mRad23B. Les protéines mRad23 contrôleraient donc le niveau basal et induit de XPC.

Figure 9. Modèle de régulation de XPC par mRad23. En absence des protéines mRad23, la protéine

XPC est instable et dégradée via le protéasome 26S. Le niveau basal est diminué, et l’activité GG-NER réduite. En conditions normales, les protéines mRad23 stabilisent XPC et contrôlent sa dégradation. En présence de dommages, le taux de XPC augmente et la protéine s’accumule dans le noyau, stimulant le GG-NER. Le point d’interrogation représente d’autres facteurs qui pourraient être régulés par les protéines mRad23. (D’après Ng et al, 2003)

1.5.2.2. Les protéines Rad23A et Rad23B humaines ont des fonctions distinctes chez l’homme ?

Chez l’homme, 10% de Rad23B est complexée à XPC (van der Spek et al, 1996). Les protéines Rad23A et Rad23B migrent différemment dans un gel non-dénaturant, suggérant qu’elles n’adoptent pas la même conformation. Le complexe purifié XPC/Rad23B a été décrit comme ayant une taille d’environ 500-550 kDa. Dans des extraits cellulaires il a une taille plus importante, suggérant que XPC/Rad23B fait partie d’un plus gros complexe. La réduction des deux protéines par interférence ARN à court terme dans des cellules dérivées de cellules HeLa a permis de montrer que les deux protéines étaient requises pour le NER (Hsieh et al, 2005). En effet, des cellules Rad23BKD et Rad23A+BKD sont sensibles aux UVC et des cellules Rad23AKD sont légèrement plus sensibles que des cellules contrôles. Ces cellules ont une activité de réparation de l’ADN réduite, montrant que Rad23A ou B sont incapables de compenser la réduction d’une des protéines. De plus, après la déplétion de Rad23A et suite à une irradiation aux UVC, l’expression du gène XP-C n’est plus induite, suggérant que Rad23A intervient dans le NER en régulant l’expression de XPC. Une expérience

statut effet absence des protéines mRad23 normal ADN endommagé GG-NER déficient GG-NER GG-NER

protéolyse via le protéasome 26S

faible taux de XPC

protéolyse contrôlée par mRad23

taux normal de XPC

protéolyse contrôlée par mRad23

accumulation de XPC statut effet absence des protéines mRad23 normal ADN endommagé GG-NER déficient GG-NER GG-NER

protéolyse via le protéasome 26S

faible taux de XPC

protéolyse contrôlée par mRad23

taux normal de XPC

protéolyse contrôlée par mRad23

d’immunoprécipitation a montré que Rad23A était majoritairement liée à p53. Rad23A pourrait ainsi réguler l’expression de XPC via son interaction avec p53.

Les interactions des deux protéines avec le protéasome et des protéines ubiquitinées ont été analysées (Chen et al, 2006). Le domaine Ubl de Rad23B mais pas celui de Rad23A peut lier le protéasome de levure. De plus, les domaines UBA et Ubl ainsi que les protéines entières forment des interactions distinguables avec le protéasome humain et des protéines ubiquitinées. Ces approches in vitro montrent ainsi que les deux protéines Rad23 humaines auraient des fonctions spécifiques, indépendamment de leur rôle dans la réparation de l’ADN. Elles sont donc multifonctionnelles.

1.5.2.3. Un rôle dans la régulation de p53 ?

Les protéines Rad23, en association avec mdm2, seraient impliquées dans la régulation du turn-over de p53 (Glockzin et al, 2003 ; Brignone et al, 2004). La surexpression de Rad23A ou B entraîne l’accumulation de formes ubiquitinées de p53, alors que leur réduction entraîne sa dégradation protéasomale. Les effets des protéines Rad23 sur la dégradation des protéines seraient donc fortement dépendants de leurs variations stœchiométriques : en excès, elles peuvent inhiber la dégradation protéasomale.

Après un traitement avec des agents endommageant l’ADN comme les UV, l’étoposide ou la mitomycine C, la présence de Rad23B est requise pour l’accumulation et l’activation de p53, et par conséquence pour le déclenchement de l’apoptose (Kaur et al, 2007). Rad23B colocalise avec des formes ubiquitinées de p53 au niveau du promoteur de p21 montrant que ces formes spécifiques de p53, protégées par Rad23B, seraient impliquées dans la réponse transcriptionnelle après un stress génotoxique.

En conclusion, en fonction du contexte cellulaire et de la stœchiométrie des composants, les protéines Rad23A et Rad23B peuvent induire ou inhiber la dégradation de protéines essentielles à la réponse au stress comme XPC et p53. Afin de caractériser les rôles de ces protéines dans la réparation de l’ADN, la plupart des études in vivo ont été réalisées chez la souris. Les fonctions de Rad23A et Rad23B chez l’homme restent encore à déterminer.