Rôle de la galectine 8 dans le recrutement de TBK1

Afin de déterminer si Gal8 est recrutée aux mêmes sites que TBK1 activé dans les cellules infectées, c’est-à-dire sur les membranes rompues, et si elle est nécessaire à la relocalisation de TBK1, nous avons analysé par immunofluorescence la localisation de Gal8 et pTBK1 dans les cellules infectées (Figure 48). Les cellules ont été traitées avec des ARN interférents contrôles (si Contrôle) ou dirigés contre la galectine 8 (si Gal8) afin de déterminer le rôle de cette dernière dans le recrutement de TBK1. Le signal de Gal8 apparaît en cyan et celui de pTBK1 en rouge. Comme dans les expériences d’immunofluorescences précédentes, la détection de la protéine VI du virus (en vert) sert de marqueur des sites de rupture membranaire induits par le virus.

Résultats

171 Figure 48: Etude du recrutement de pTBK1 aux sites de dommage membranaire en absence de galectine 8

Les cellules U2OS sont transfectées avec des si ARN contrôle (si Contrôle) ou dirigés contre la Gal8 (si Gal8). Les cellules sont infectées avec 5 000 pp/c d’AdV M1. Une immunofluorescence est réalisée 30 min post-infection, avec des anticorps anti protéine VI (en vert), anti pTBK1 (en rouge), anti Gal8 (en cyan) et le DAPI est utilisé pour marquer le noyau (en gris). Les images sont obtenues par microscopie à fluorescence confocale. Les flèches représentent des exemples de colocalisations entre pTBK1 et VI (colonne de gauche), de colocalisations entre pTBK1 et Gal8 (colonne du milieu) et de colocalisations entre pTBK1, la protéine VI et Gal8 (colonne de droite).

Résultats

172 Pour ces expériences, le virus mutant M1 est utilisé car c’est ce virus qui reste le plus longtemps associé aux endosomes rompus et facilite donc la détection des événements de colocalisations.

Les cellules sont infectées 30 min avec 5 000 pp/c du mutant puis sont fixées et analysées par microscopie confocale. Les images des différents plans focaux obtenus sont projetées sur une seule image, dont un exemple est présenté dans la figure 48. L’expression de Gal8 ainsi que sa déplétion sont vérifiées respectivement sur le panel du haut (si Contrôle) et du bas (si Gal8). Dans les cellules contrôles infectées, la protéine VI colocalise avec pTBK1 et on observe une colocalisation entre pTBK1 et Gal8. Des évènements de triple colocalisation sont également détectés entre pTBK1 / VI / Gal8. Ces signaux pourraient correspondre à l’activation de TBK1 au niveau des membranes endommagées détectées par Gal8 et donc par l’autophagie pour dégradation. En absence de Gal8, la protéine VI est exposée, mais pTBK1 n’est pas détecté. Ce qui confirme les données du western-blot indiquant que Gal8 est nécessaire pour induire l’activation de TBK1. Il semblerait donc qu’en absence de Gal8, la protéine TBK1 ne soit plus activée, ni recrutée aux sites de dommage membranaire marqués par la protéine VI.

Afin de confirmer ces données, une quantification semi-automatique est effectuée pour dénombrer les signaux de colocalisation en présence ou en absence de Gal8.

Dans un premier temps, les colocalisations entre la protéine VI et pTBK1 sont quantifiées puis normalisées par le nombre de protéine VI détectées afin de représenter le pourcentage de dommages membranaires ayant recrutés pTBK1 en fonction de la présence ou non de Gal8

(Figure 49A). Nous remarquons qu’en présence de Gal8, environ 10 % des sites de rupture

membranaire sont positifs pour pTBK1 30 min après l’infection par le virus M1. En revanche, lorsque l’expression de Gal8 est réduite, TBK1 n’est plus recruté aux sites de rupture membranaire. Il semble donc que la présence de Gal8 soit nécessaire pour le recrutement de TBK1.

Pour confirmer le rôle de Gal8 dans le recrutement et l’activation de TBK1, les colocalisations entre ces deux protéines sont quantifiées. Ces valeurs sont normalisées par le nombre de pTBK1 détectés afin d’exprimer le pourcentage de TBK1 associé à Gal8

Résultats

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Figure 49: Quantification du recrutement de pTBK1 aux sites de dommage membranaire en absence de galectine 8

(A) Les images obtenues par microscopie à fluorescence confocale, sont analysées avec le logiciel Image J afin

de quantifier les colocalisations entre la protéine VI et pTBK1. Ces colocalisations sont ensuite normalisées par le nombre de protéine VI détectées afin d’exprimer le pourcentage d’endosomes rompus positifs pour TBK1. Le graphique représente ces résultats dans les cellules transfectées avec le si ARN contrôle (en noir) ou le si ARN ciblant Gal8 (en violet). (B) Les images obtenues par microscopie à fluorescence confocale, sont analysées avec le logiciel Image J afin de quantifier les colocalisations entre Gal8 et pTBK1. Ces colocalisations sont ensuite normalisées par le nombre de pTBK1 détecté afin de représenter le pourcentage de TBK1 recruté par Gal8. Le graphique représente ces résultats dans les cellules transfectées avec le si ARN contrôle (en noir) ou le si ARN ciblant Gal8 (en violet). (C) Les images obtenues par microscopie à fluorescence confocale, sont analysées avec le logiciel Image J afin de quantifier les colocalisations entre la protéine VI, pTBK1 et Gal8. Ces colocalisations sont ensuite normalisées par le nombre de pTBK1 détectées afin d’exprimer le pourcentage de TBK1 recrutés aux sites de l’autophagie. Le graphique représente ces résultats dans les cellules transfectées avec le si ARN contrôle (en noir) ou le si ARN ciblant Gal8 (en violet).

Résultats

174 Nous remarquons ainsi que, dans les cellules infectées par le virus M1, environ 50 % de la forme phosphorylée de TBK1 est recrutée sur des structures positives pour Gal8. La majorité de TBK1 phosphorylé est donc retrouvée en association avec Gal8.

Pour confirmer que ces sites de recrutement de pTBK1 par Gal8 correspondent aux sites de dommage membranaire induits par le virus, les triples colocalisations entre la protéine VI Gal8 et pTBK1 sont quantifiées. Ces résultats sont normalisés par le nombre total de pTBK1 détecté (Figure 49C). Nous remarquons ainsi que 22 % de la forme phosphorylée de TBK1 sont recrutés sur ces structures qui correspondraient aux endosomes rompus reconnus par Gal8. Le recrutement de TBK1 semblerait donc avoir un lien avec l’activation de l’autophagie permettant de dégrader les endosomes rompus, et par extension le virus M1 qui ne peut pas s’en échapper efficacement.

Ces résultats indiquent que Gal8 est nécessaire pour l’activation et le recrutement de TBK1 aux sites de dommage membranaire induits par l’AdV. La triple colocalisation entre protéine VI / pTBK1 / Gal8 suggère que ces structures correspondent aux endosomes rompus contenant le virus et induisant sa dégradation s’il ne s’en échappe pas, comme c’est le cas pour le mutant M1. Sachant que Gal8 est nécessaire à l’activation de l’autophagie induite par l’AdV (Montespan et al., 2017), nos résultats suggèrent un lien direct entre l’activation de TBK1 par les dommages membranaires induits par le virus et l’autophagie dépendante de Gal8.

Dans le cas de Salmonella thyphimurium, il a été montré que Gal8 est recrutée au niveau des vacuoles lysées par la bactérie et que ceci permet le recrutement et l’activation de TBK1. Dans ce modèle, cette étape nécessite la présence d’un adaptateur de l’autophagie, NDP52 qui interagit directement avec Gal8 et recrute indirectement TBK1 (Thurston et al., 2016). Dans la suite de ce travail, nous avons voulu savoir si l’activation de TBK1 au cours de l’infection par l’AdV dépend du même mécanisme et nous avons donc étudié l’implication des adaptateurs de l’autophagie dans la phosphorylation de TBK1.

Résultats

175 III- Rôle des adaptateurs conventionnels de l’autophagie dans l’activation de TBK1