Effet des inhibiteurs Bx795 et MRT67307

1- Vérification de l’inhibition fonctionnelle de TBK1

Deux inhibiteurs fonctionnels de TBK1 sont couramment utilisés dans la littérature. Il s’agit de Bx795 (Clark et al., 2009) et de MRT67307 (Yu et al., 2015). Malgré leur utilisation, le mécanisme d’inhibition de ces drogues est controversé. En effet, Bx795 est utilisé comme inhibiteur de la phosphorylation de TBK1. Cependant, plusieurs études rapportent au contraire une augmentation de cette phosphorylation en présence de l’inhibiteur (Clark et al., 2009 ; Hasan et al., 2015).

Afin de déterminer l’effet de Bx795 et de MRT67307 dans nos conditions expérimentales, nous avons analysé le niveau de phosphorylation de TBK1 induit par l’infection en présence ou non de ces inhibiteurs. Des cellules U2OS sont traitées pendant 3 h avec 2 concentrations différentes de Bx795 ou 3 concentrations de MRT67307 puis infectées avec 5 000 pp/c d’AdV WT pendant 30 min. Le DMSO et l’eau servent respectivement de contrôles pour Bx795 et MRT67307, du niveau de phosphorylation de TBK1 induit par l’infection seule (Figure 56). L’analyse du western blot met en évidence que la phosphorylation de TBK1 est supérieure dans les conditions traitées avec Bx795 comparé aux conditions contrôles (Figure

56A). L’inhibiteur MRT67307 n’a quant à lui pas d’effet clair sur la phosphorylation de

TBK1 (Figure 56B). Nos données pour Bx795 sont en corrélation avec les résultats publiés, nous ne pouvons donc pas utiliser le niveau de phosphorylation de TBK1 comme marqueur de l’efficacité du traitement.

Résultats

189 Figure 56: Etude de l’effet des inhibiteurs de TBK1 sur sa phosphorylation

Les cellules U2OS sont prétraitées pendant 3 h avec différentes concentrations de Bx795 (A) ou de MRT67307 (B) puis sont infectées avec 5 000 pp/c d’AdV WT. Les cellules sont lysées 30 min post-infection puis analysées par western blot pour l’expression de TBK1 sous sa forme phosphorylée (pTBK1) et total (TBK1). L’actine sert de contrôle de charge. L’intensité des bandes pTBK1, TBK1 et actine est mesurée pour MRT67307 et le rapport pTBK1 par TBK1 est calculé.

Résultats

190 Pour vérifier l’inhibition fonctionnelle de TBK1 par ces inhibiteurs, nous avons donc testé la translocation nucléaire d’IRF3 suite à son activation par TBK1 en réponse au poly IC. Pour ce faire, une expérience d’immunofluorescence a été réalisée (Figure 57). Les cellules U2OS sont prétraitées pendant 3 h avec 5 µM de Bx795 ou de MRT67307 et ensuite transfectées ou non avec 2 µg/mL de poly IC. Les cellules sont fixées 3 h après la transfection puis l’immunofluorescence est réalisée à l’aide d’anticorps ciblant IRF3 (en vert) et de DAPI pour marquer le noyau. Les images obtenues par microscopie confocale indiquent que le poly IC induit la relocalisation d’IRF3 dans le noyau dans les cellules contrôles (panel du haut). Au contraire, celle-ci est inhibée dans les cellules traitées avec les différents inhibiteurs où IRF3 est détecté seulement dans le cytoplasme même après stimulation par le poly IC. Ces résultats confirment l’inhibition fonctionnelle de TBK1 par ces inhibiteurs qui peuvent donc être utilisés dans nos expériences pour analyser le rôle de TBK1 dans l’activation de l’autophagie. Cependant, ces inhibiteurs ne sont pas spécifiques de TBK1, puisqu’ils limitent également l’activation d’autres kinases telles que AKT et ULK1 (Feldman et al., 2005 ; Petherick et al., 2015 ; Jaishankar et al., 2018). Ainsi, l’effet de ces inhibiteurs sera tout d’abord étudié seul afin d’observer une tendance concernant l’état de l’autophagie suite à l’inhibition fonctionnelle de TBK1. Puis ces données seront reproduites dans des cellules préalablement déplétées pour TBK1 afin de confirmer que l’effet observé est bien dépendant de l’inhibition de TBK1, et non d’un effet aspécifique.

2- Effet des inhibiteurs Bx795 et MRT67307 sur l’infectiosité du M1

Pour tester l’effet de l’inhibition de TBK1 sur l’activation de l’autophagie induite par l’AdV, les cellules U2OS sont prétraitées pendant 3 h avec différentes concentrations de Bx795 (Figure 58A) ou de MRT67307 (Figure 58B). Les cellules sont infectées avec 50 pp/c des vecteurs WT et M1 exprimant la GFP. Le pourcentage de cellules infectées est déterminé par cytométrie en flux. Deux expériences indépendantes sont réalisées pour chaque inhibiteur et les figures 58A et 58B représentent l’infectiosité du virus M1 normalisé par celle du virus WT (obtenu dans les mêmes conditions de traitement) respectivement pour Bx795 et MRT67307.

Pour ce qui est de Bx795, en absence d’inhibiteur, 44 % des cellules sont infectées avec le virus WT, contre 2,6 % avec le virus M1 (données non montrées), soit un virus mutant 17 fois moins infectieux (Figure 58A). L’utilisation de Bx795 augmente légèrement l’infectiosité du mutant M1 en fonction de la concentration utilisée.

Résultats

191 Figure 57: Etude de la translocation nucléaire d’IRF3 en présence d’inhibiteurs

Les cellules sont prétraitées pendant 3 h avec du DMSO ou les différents inhibiteurs de TBK1, puis sont transfectées pendant 3 h avec 2 µg/mL de poly IC. Une immunofluorescence est réalisée avec des anticorps ciblant IRF3 (en vert) et le DAPI est utilisé pour marquer le noyau (en gris). Les images sont obtenues par microscopie à fluorescence confocal.

Résultats

192 Ainsi, avec la dose la plus faible, 8 % des cellules sont infectées par le virus M1 (41,8 % avec le WT) contre 11,8 % avec la dose la plus élevée (32,6 % avec le WT). Dans cette dernière condition le virus M1 n’est plus que 3 fois moins infectieux que le virus WT. L’infectiosité du virus M1 est donc supérieure en présence de Bx795, alors que celle du WT diminue légèrement. Cependant, les différences observées avec les différentes concentrations de Bx795 ne sont pas significatives. Nous souhaitons donc les confirmer en utilisant l’autre inhibiteur de TBK1.

Avec le MRT67307, l’infectiosité du virus M1 augmente graduellement de façon significative avec le traitement (Figure 58B), et celle du WT diminue légèrement de façon non significative (données non montrées). Ainsi, en présence de 25 µM de MRT67307, le mutant M1 n’est plus que 1,5 fois moins infectieux que le WT (contre 10 fois dans les conditions contrôles). Les résultats obtenus avec MRT67307 confirment donc la tendance observée précédemment avec le Bx795.

L’utilisation de ces inhibiteurs fonctionnels de TBK1 semble donc augmenter l’infectiosité du virus M1, qui normalement est dégradé par autophagie. Pour confirmer que cet effet est bien la conséquence de l’inhibition spécifique de TBK1, et non d’un effet des inhibiteurs sur l’autophagie en général, leur utilisation a été couplée à la déplétion de TBK1 par ARN interférence.

Figure 58 : Etude de l’effet des inhibiteurs de TBK1 sur l’infectiosité du virus M1

Les cellules U2OS sont prétraitées pendant 3h avec différentes concentrations de Bx795 (A) ou de MRT67307 (B) puis sont infectées avec 50 pp/c des vecteurs WT ou M1. Le pourcentage de cellules exprimant la GFP est analysé par cytométrie en flux et est normalisé par l’infectiosité du virus WT. n.s = non significatif, * = P<0,05; ** = P<0,01; *** = P<0,001; *** = P<0,0001.

Résultats

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C) Combinaison de la déplétion partielle et de l’inhibition fonctionnelle de