D.2. Les rétroposons ingi produisent deux classes de transcrits

Nos résultats précédents illustrent la grande diversité de transcrits ingi/RIME qui reflète leur hétérogénéité dans le génome (Bringaud et al., 2004). Ces observations suggèrent que les rétroposons pourraient être soumis à différents types de régulation, peut-être aussi en fonction de leur site d’insertion. Afin d’approfondir cette hypothèse, nous avons analysé les conséquences de la présence d’un inhibiteur du trans épissage, la sinéfungine, sur l’expression des transcrits ingi.

Chez les cellules sauvages et TbAGO1-/-, nous avons d’abord effectué un contrôle pour vérifier l’inhibition du trans épissage dans nos cellules en suivant par northern blot l’expression de P F R A. En absence de sinéfungine, les deux lignées expriment normalement l’ARNm de PFRA et les transcrits d’ARN polycistroniques ne sont pas détectés, vu l’efficacité du trans épissage (figure 43 A). L’incubation des cellules pendant 90 minutes avec 2µg/ml de sinéfungine induit l’accumulation des pré-ARNm non épissés de PFRA chez les deux lignées ; ce phénomène affecte inévitablement la production des ARNm matures de PFRA, mais n’affecte pas l’expression d’ARN indépendant du trans épissage comme les ARN ribosomiques (figure 43 A). Après avoir vérifié l’action de la sinéfungine, nous avons analysé les conséquences de l’inhibition du trans épissage sur l’expression des ingi des lignées sauvage et TbAGO1-/-. Les cellules sauvages non traitées expriment faiblement les transcrits ingi et en présence de la sinéfungine leur expression est affectée avec l’apparition d’un « nuage » de transcrits de plus grande taille (figure 43 B).

Ceci suggère que certains transcrits ingi pourraient être épissés. Cette observation est confirmée chez les cellules TbAGO1-/-, où la sinéfungine affecte l’expression de la majorité des transcrits ingi surexprimés. Cependant, certains transcrits ingi d’environ 5kb sont insensibles à la présence de l’inhibiteur (flèche, figure 43 A) indiquant qu’ils ne passent pas par la voie de trans épissage. Nos résultats suggèrent donc qu’il existe deux classes de transcrit ingi. La première classe, sensible à la sinéfungine, serait maturée par trans épissage. L’analyse de la disposition des ingi dans le génome montre que cette classe de transcrits pourrait correspondre à la transcription de gène/pseudogène ayant intégré ce rétroposon. La seconde famille, de taille d’environ 5kb (flèche figure 43 B), serait indépendante de ce mécanisme et pourrait correspondre à l’élément ingi intact ne possédant pas de signaux pour le trans épissage.

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Figure 44

Les transcrits RHS1 sont surexprimés en absence d’ARNi

A/ Analyse des transcrits RHS1 par northern blot.

B/ Quantification de l’expression des R H S 1 chez les différentes lignées.

C/ Surexposition de la membrane marquée avec RHS1.

D/ Détection des transcrits ingi sur la même membrane.

La quantification des mêmes échantillons a été effectuée sur 3 membranes différentes avec le logiciel ImageQuant. Dépôt de 10µg d’ARN totaux par puit.  Les sondes ont été marquées par random priming. La sonde RHS1 marque la séquence codante (+1521 à +2050).

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II.D.3. TbAGO1 contrôle l’expression des gènes RHS1

Les RHS sont une grande famille de gènes qui est divisée en six groupes, de RHS1 à RHS6. Les gènes RHS1, au nombre de 28 copies par génome haploïde chez T. brucei, possèdent fréquemment les éléments ingi/RIME insérés dans leurs séquences formant ainsi des pseudogènes (Bringaud et al., 2002). Vu les régulations auxquelles sont soumises les rétroéléments, nous avons donc analysé l’expression du gène RHS1 par northern blot.

La lignée sauvage exprime des transcrits de RHS1 correspondant à la taille attendue d’environ 3kb (figure 44 A)(Bringaud et al., 2002). Cependant, les cellules TbAGO1-/-, montrent une augmentation sensible de l’abondance des transcrits de RHS1 par rapport à la lignée sauvage suggérant que l’ARNi régule l’expression de ces transcrits.

Pour établir la spécificité de ces résultats, nous avons utilisé la lignée inductible TbAGO1-/-+GFP::TbAGO1Ti. Les cellules TbAGO1-/-+GFP::TbAGO1Ti induites expriment les ARNm RHS1 au même niveau que la lignée sauvage. Par contre, en absence de tétracycline (ARNi non fonctionnelle), les cellules TbAGO1-/-+GFP::TbAGO1Ti présentent un niveau d’ARNm RHS1 équivalent au TbAGO1-/- (figure 44 A). La normalisation des transcrits RHS1 par l’ARNm du gène codant l’alpha tubuline montre qu’en absence de TbAGO1, la quantité des ARNm de RHS1 est environ deux fois supérieure, par rapport aux cellules exprimant la protéine TbAGO1 normale ou chimérique (figure 44 A).

L’exposition prolongée de la membrane hybridée avec la sonde RHS1 révèle d’autres transcrits RHS1 de grande taille (environ 4,5 et 8kb) pouvant correspondre à des pseudogènes RHS1 ayant intégré des fragments complets ou incomplets de ingi ou plusieurs RIME (Bringaud et al., 2002)(figure 44 C et D). Il est troublant d’observer que certaines bandes présentent une mobilité semblable à celle détectée par la sonde ingi (ou RIME A, figure 42)

En conclusion, ces résultats démontrent que la présence de la protéine TbAGO1 contrôle l’abondance des ARNm RHS1. Le mode exact de cette régulation demeure inconnu mais la présence fréquente des ingi/RIME insérés ou localisés au niveau des gènes RHS1 dans le génome, suggère l’implication des ingi/RIME contrôlés par ARNi dans le contrôle de l’expression des ARNm RHS1.

127 Figure 45 

Cinétique de dégradation des ARNm de PFRA chez les lignées snl-2 et PFRAi A/ Détection des transcrits PFRA chez snl-2 (exprimant l’ARNdb de PFRA en épingle à cheveux avec les signaux d’épissage, SL et polyA), non induites et induites analysés à différents temps. B/ Quantification de l’expression de l’ARNm de PFRA chez les lignées snl-2 et PFRAi.

Induction à la tétracycline (1µg/ml) dans le milieu de culture. Pour la quantification, la membrane marquée par la sonde PFRA, a été réhybridée avec une sonde spécifique de l’alpha-tubuline (voir Durand-Dubief et al. 2003).

L’expérience a été reproduite deux fois. Dépôt : 5µg d’extraits ARN totaux par puit.

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