Une découverte essentielle fut effectuée au sein du laboratoire de David Baulcombe : la dégradation de l’ARN induite par le PTGS s’accompagne de la production d’ARN de petite taille («small interferent RNA » ou siARN). Ces siARN sont d’une longueur moyenne de 25 nucléotides correspondant aux séquences sens et antisens de l’ARN cible (Hamilton and Baulcombe, 1999). Les siARN produits par le mécanisme PTGS/ARNi/Quelling furent ensuite détectées dans de nombreuses autres d’espèces.
Les plus importantes découvertes furent réalisées chez l’insecte Drosophila melanogaster par une dissection approfondie du phénomène ARNi en utilisant des systèmes d’études in vitro et in vivo. Dans un système in vitro dérivé d’embryon de drosophile, l’introduction d’ARNdb
entraîne la dégradation spécifique de l’ARNm correspondant en produisant des fragments d’ARN de 21 à 23 nucléotides. Thomas Tuschl et ses collaborateurs démontrèrent que ces siARN sont générés à partir du double brin d’ARN et suggérèrent que les siARN sont les éléments nécessaires pour guider le clivage de l’ARN cible (Elbashir et al., 2001b; Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000). Ces petits fragments d’ARN sont caractérisés par une extrémité dépassante hydroxylée en 3’ de deux à trois nucléotides et avec une phosphorylation en 5’ (5’-P) (Elbashir et al., 2001a).
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Par ailleurs, le traitement de cellules de drosophile S2 en culture avec de l’ARNdb a permis de purifier une fraction active possédant l’activité d’extinction spécifique dégradant l’ARN cible. La fraction active purifiée perd son activité suite au traitement avec la nucléase de microcoque (ARN + ADN) mais pas après incubation avec la DNase, indiquant la présence indispensable d’ARN (Hammond et al., 2000). Cette fraction purifiée ayant une activité ribonucléase spécifique fut appelée RISC (pour « RNA-Induced Silencing Complex »). Une analyse plus poussée démontre que ce complexe ribonucléoprotéique, faisant 500kDa, cofractionne avec des ARN d’une taille de 25 nucléotides dérivant de la séquence de l’ARNdb introduit (Hammond et al., 2000). Ces résultats suggèrent donc que les petits ARN associés au complexe guident la nucléase pour permettre la reconnaissance spécifique de l’ARN cible (figure 1)(Elbashir et al., 2001a).
En résumé :
(a) les longs fragments d’ARNdb sont découpés en petits ARNdb de 21-23pb par une ribonucléase spécifique de l’ARNdb, Dicer ;
(b) les siARN guident un complexe protéique contenant l’activité enzymatique RISC, vers le substrat via un appariement du brin siARN antisens à l’ARNm induisant sa dégradation.
15 Figure 1
Représentation schématique de la voie ARN interférence
L’ARNdb est fragmenté en siARN par la ribonucléase Dicer. Les siARN sont ensuite pris en charge par le complexe RISC. L’activation du complexe RISC permet la dégradation spécifique de l’ARN correspondant guidé par le siARN (Adaptée de Dykxhoorn et al. 2003).
16 I.A.5.b Les microARN
Le clonage et le séquençage des siARN ont permis l’identification d’une sous-classe de petits ARN : les microARN ou miARN. Les membres de cette nouvelle classe d’ARN n’ont pas de fonctions codante (Lagos-Quintana et al., 2001; Nelson et al., 2001; Rosalind et al., 2001;
Bartel, 2004).
Les microARN sont synthétisés à partir de précurseurs dont la maturation fait intervenir au moins deux ribonucléases de type III (doubles brins) : Drosha et Dicer (Hutvagner et al., 2001;
Lee et al., 2003). Dans le nucléoplasme, l’enzyme Drosha convertit un transcrit primaire (ou pri-miARN) en une structure en épingle à cheveux : le pré-miARN, d’une longueur d’environ 70 nucléotides. Les pré-miARN sont ensuite exportés dans le cytoplasme par un processus Ran-GTP dépendant impliquant l’exportine-5 (Lee et al., 2003; Lund et al., 2004) puis sont pris en charge par la ribonucléase Dicer (Lee et al., 2003). Celle-ci génère alors des petits ARNdb, similaires aux siARN et nommés miARN:miARN. Un seul des brins du duplex miARN:miARN est alors intégré dans un complexe de type RISC qui interagit ensuite avec l’ARNm : le RISC-miRNP (« RNA-induced silencing complex- micro-ribonucleoprotein ») (Khvorova et al., 2003;
Schwarz et al., 2003).
Les modalités d’action de RISC-miRNP, encore mal comprises, semblent être contrôlées par la qualité du duplex miARNguide:ARNm mis en jeu (figure 2) (Bartel, 2004; Murchison and Hannon, 2004):
Si la complémentarité du miARN est parfaite avec l’ARN cible : le complexe RISC-miARN clive au milieu de l’hybride miARN-ARNm, comme les siARN.
Si le miARN guide n’est pas totalement complémentaire à la séquence de l’ARNm (mésappariement): l’ARNm n’est pas clivé, mais on observe alors une inhibition de sa traduction.
Selon le type d’organisme (plantes ou animaux), il semble que le degré de complémentarité des miARN avec leur cible varie. Les plantes favoriseraient davantage un mode de dégradation de l’ARNm par une forte homologie du miARN avec l’ARNm cible alors que la branche animale s’orienterait d’avantage sur un mode de répression traductionnelle qui préserverait la stabilité des ARNm ciblés (Ambros, 2004; Bartel, 2004). Dans le cas d’une inhibition de la traduction, on remarque que les microARN ciblent généralement dans la région 3’ non traduite des ARNm (ou 3’UTR) (Jackson et al., 2003; Rhoades et al., 2002).
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Les miARN sont parfois regroupés et pourraient être transcrits de manière polycistronique (Bartel, 2004).
Figure 2
Modèle actuel sur la biogenèse des microARN et la répression post-transcriptionnelle
Le transcrit pri-microARN (pri-miARN) est transformé en pre-miARN d’environ 70nt par la ribonucléase Drosha dans le noyau. Les pre-miARN sont transportés vers le cytoplasme par l’exportine 5 et sont transformés en duplexes miARN:miARN* par Dicer (comme les longs ARNdb). Un seul brin du duplex miARN:miARN* est préférentiellement assemblé dans le complexe RISC. En fonction du degré de complémentarité du miARN*, celui-ci va agir comme répresseur traductionnel ou dans la voie de clivage de l’ARNm correspondant. (He et al 2004)
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Le complexe RISC fait intervenir plusieurs acteurs. Pour identifier les protéines participant à la machinerie ARNi, en plus des purifications biochimiques, de nombreux mutants ont été produits chez le nématode Caenorhabditis elegans, la plante Arabidopsis thaliana, l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii et le champignon Neurospora crassa.
Ici, nous décrirons la majeure partie des connaissances actuelles sur le rôle des différents intervenants du mécanisme de l’ARN interférence.