C.2.b.6 Analyse de la mobilité des rétroposons chez la lignée TbAGO1-/-

TbAGO1-/-La surexpression des rétroéléments ingi chez la lignée TbAGO1-/- est-elle associée à une augmentation de leur activité de rétrotransposition et leur réintégration dans le génome ? Pour détecter d’éventuelles modifications du génome, les lignées sauvage et TbAGO1-/- ont été maintenues plusieurs mois en culture continue. Si l’activité de rétrotransposition augmente, celle-ci devrait pouvoir se manifester au niveau de l’abondance et la localisation d’ingi dans l’ADN.

La lignée TbAGO1-/- maintenue en culture a été renommée TbAGO1-/-*. Deux analyses ont été effectuées pour détecter ingi par Southern blot et par PCR pour détecter les éléments RIME. Pour la première analyse, nous avons utilisé une sonde spécifique de l’élément ingi pour marquer l’ADN génomique des lignées WT et TbAGO1-/-* digéré par différentes enzymes de restriction (SphI et BamHI)(Murphy et al., 1987). Les résultats du Southern Blot (figure 37) ne révèlent pas de différences significatives entre les profils d’hybridation des deux lignées et suggèrent qu’il n’y a pas eu de modification majeure des éléments ingi suite à leur surexpression.

Figure 37

Southern blot par la sonde ingi (1-1402nt) sur l’ADN génomique des cellules sauvages et TbAGO1-/-*

(1) 1kb+ ladder coloré au bromure d’éthydium (BET) (2 & 4) ADN génomique de cellules sauvages digéré respectivement par les enzymes de restriction BamHI et SphI. (3 & 5) ADN génomique de TbAGO1-/- digéré respectivement par les enzymes de restriction BamHI et SphI.

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Pour confirmer les observations obtenues par Southern blot, nous avons utilisé la MGE-PCR (Mobile Genetic Element-PCR), technique plus sensible employée avec succès pour différentier les souches de T. brucei sur le terrain (figure 38) (Terry et al., 2001;

Tilley et al., 2003). Révélée par gel d’agarose, la MGE-PCR permet d’apposer une

« empreinte » fiable des éléments RIME d’un génome. Notre analyse par MGE-PCR confirme nos résultats précédents et démontrent un profil similaire entre la souche sauvage et TbAGO1-/-* (figure 39).

En conclusion, la culture des lignées TbAGO1-/-* pendant plusieurs mois n’a pas permis de détecter des modifications majeures par Southern blot et MGE-PCR et suggère qu’il n’y a eu que peu ou pas de nouvelles intégrations des rétroéléments ingi et RIME dans le génome. Ces résultats indiquent que la surexpression des éléments ingi n’induit pas de mobilisation massive des rétroposons ingi/RIME et suggèrent qu’ils ne seraient pas directement responsables des défauts de mitose et de ségrégation initialement observés dans les cellules TbAGO1-/-.

Figure 38

Mode d’amplification des amorces RIME A, RIME et REV B.

(A.) Information sur la longueur du polymorphisme par amplification des fragments contenue dans la répétition des éléments. L’amorce REVB s’apparie aux séquences inversées au début et à la fin du rétroélément

(B.) Information sur les variations de position par amplification des éléments d’ADN flanquants entre les é l é m e n t s. L’amorce REVB s’apparie sur les répétitions homologues ou deux éléments différents.

(C.) Information sur les variations de position par amplification de l’ADN adjacent. L’amorce s’apparie aux répétitions mais peut sous des conditions permissives s’apparier à l’ADN flaquant.

(adaptée de Terry et al. IJP 01 et Tilley et al. Exp. Parasitology 2003)

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II.C.2.b.7 Adaptation des cellules TbAGO1-/-*

Au cours de ces expériences, nous avons constaté que la croissance de la lignée TbAGO1-/-* s’est progressivement améliorée, pour parvenir à un temps de doublement d’environ 10h alors que celui des cellules TbAGO1-/- d’origine est de 16h (Durand-Dubief and Bastin, 2003). Nous avons analysé par immunofluorescence au moyen d’anticorps anti-tubuline et par coloration de l’ADN au DAPI le comportement de ces cellules. En grande majorité, les cellules TbAGO1-/-* sont à nouveau capables d’assembler un fuseau mitotique normal, se traduisant par une mitose normale. Moins de 5% des cellules * présentent un fuseau mitotique aberrant au contraire des cellules TbAGO1-/-d’origine (près de la moitié de fuseaux aberrants)(Durand-Dubief and Bastin, 2003). Ces résultats suggèrent une adaptation de la lignée TbAGO1-/-* et une compensation progressive des défauts mitotiques.

Nos observations précédentes ont montré qu’il n’existe pas une forte mobilité des rétroposons ingi/RIME dans le génome. Si la surexpression des rétroéléments était responsable des problèmes de croissance, il est plausible qu’elle est à nouveau contrôlée par un autre mécanisme. Nous avons donc analysé l’expression des éléments ingi chez les cellules de la lignée TbAGO1-/-*.

Figure 39

La lignée TbAGO1-/-* ne révèle pas de mouvement des rétroposons RIME dans le génome.

MGE-PCR analysée sur gel d’agarose 0.8% coloré au bromure d’éthydium. (1) 1kb+ ladder; (2) et (3) Produits d’amplification de l’ADN génomique des lignées sauvages et de TbAGO1-/-* par les amorces RIME A/B (4) et (5) Produits d’amplification de l’ADN génomique des lignées sauvages et de TbAGO1-/-* par l’amorce RevB

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II.C.2.b.8 La lignée TbAGO1-/-* surexprime toujours les rétroposons ingi

L’analyse par northern blot de l’expression des transcrits ingi montre que la lignée TbAGO1-/-* n’a pas réprimé la surexpression des rétroposons (figure 40). Au contraire, nous observons même une surexpression supérieure des rétroéléments à la lignée TbAGO1-/- d’origine qui présentait les problèmes au niveau de la mitose. De plus, des transcrits de taille inférieure sont détectés. Ces résultats démontrent que la lignée TbAGO1-/-* s’est adaptée à l’absence de la protéine TbAGO1 pour effectuer à nouveau une mitose normale mais sans réprimer l’expression des rétrotransposons ingi. Ce résultat démontre que la surexpression des rétroposons ingi et les défauts mitotiques observés chez le mutant TbAGO1-/- d’origine ne sont pas directement liés.

Figure 40

Les mutants TbAGO1-/-*

surexpriment toujours les rétroposons ingi.

Northern blot sur des extraits d’ARN totaux sur les lignées sauvage (W T), TbAGO1-/-(K O ) et TbAGO1-/-* (KO*).

rRNA : ARN ribosomiques c o l o r é s a u b r o m u r e d’éthidium. Échantillon : 10µg d’extraits d’ARN totaux par puits. La sonde ingi est faite par random priming et est spécifique de la région +2759-+3598 de la séquence du rétroposon ingi.

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Figure 41

Détection des transcrits ingi chez les différentes lignées.

Cellules sauvages (W T), cellules T b A G O 1 - / - (K O), rRNA: ARN ribosomiques. Northern blot sur des extraits d’ARN totaux sur les lignées 10µg/ puits. La sonde ingi est faite par random priming et est spécifique de la région +2759-+3598 de la séquence du rétroposon ingi. A gauche de l’image sont indiquées les tailles données par le marqueur.

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II.C.2.b.9 Modification du profil d’expression des rétroéléments dépendants