Résumé de la préparation d’échantillon

Deux protocoles distincts ont été développés, l’un pour l’analyse de traces de métabolites de la nandrolone NA, NE et NEA (figure 48), l’autre pour l’analyse de DHEA et androstérone (figure 49). 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000 2000000 2200000 2400000 2600000 2800000 3000000 3200000 3400000 3600000 3800000 Time--> Abundance TIC: P7033013.D 14.61 16.55 16.81 17.24 18.82 19.71 NA mono TMS ^NEA mono TMS NE mono TMS NA diTMS NEA diTMS NE diTMS

2, 5 mL d’urine tamponnée à pH 5,2 (+1 mL de tampon acétate)

dopée avec 50 µL de NE-d4 à 50 ng/mL (étalon interne)

SPE cartouche HLB (60 mg)

Conditionnement de la cartouche : 5 mL méthanol puis 5 mL eau Dépôt de l’échantillon

Rinçage du tube échantillon par addition de 3 mL d’eau Rinçage de la cartouche avec 3 mL d’eau

Séchage de la cartouche pendant 1 min Elution avec 5 mL de méthanol Evaporation à sec sous N₂ à 40°C

Hydrolyse enzymatique

50 µL de β-glucuronidase d’E. Coli +1 mL de tampon phosphate 0,04 M pH 7,2 1 h à 55 °C

puis dilution par ajout de 1 mL de tampon acétate 1 M pH 5,2

SPE cartouche HLB (60 mg)

Conditionnement de la cartouche : 5 mL de méthanol puis 5 mL d’eau Dépôt de l’échantillon

Rinçage du tube échantillon par addition de 3 mL d’eau

Rinçage de la cartouche avec 6 mL de méthanol/eau (10/90 V/V) 2% acide acétique (pH 3) 6 mL de méthanol/eau (10/90 V/V) 2% ammoniaque (pH 11)

6 mL de méthanol/eau (10/90 V/V) Séchage de la cartouche 1 min Elution avec 4 mL d’acétate d’éthyle

Evaporation à sec sous N₂ à 40°C Reprise par 2 mL d’acétate d’éthyle

SPE cartouche NH2 (aminopropylsilane) (200mg)

Conditionnement de la cartouche : 3 x 5 mL d’acétate d’éthyle Dépôt de l’échantillon

Rinçage tube échantillon par addition de 2,5 mL d’acétate d’éthyle Elution par 2 mL d’acétate d’éthyle

Evaporation à sec sous N₂ à 40 °C

Dérivation

Réactif dérivant : MSTFA/NH₄I/DTE (1000/4/2) Ajout de 50 µL de réactif dérivant

1 h à 55 °C Analyse GC/MS

Figure 48 Protocole A : analyse des métabolites de la nandrolone

Partie II

Analyse des métabolites de la nandrolone, de la DHEA et de l’androstérone dans l’urine

2,5 mL d’urine diluée 50 fois tamponnée à pH 5,2 (+1 mL de tampon acétate)

dopée avec 50 µL de NE-d4 à 1 µg/mL (étalon interne)

SPE cartouche HLB (60 mg)

Conditionnement de la cartouche : 5 mL méthanol puis 5 mL eau Dépôt de l’échantillon

Rinçage du tube échantillon par addition de 3 mL d’eau Rinçage de la cartouche avec 3 mL d’eau

Séchage de la cartouche pendant 1 min Elution avec 5 mL de méthanol Evaporation à sec sous N₂ à 40 °C

Méthanolyse

1 mL de triméthylchlorosilane 1M dans le méthanol 1 h à température ambiante

Evaporation à sec sous N₂ à 40°C

Reprise par 100 µL de méthanol puis 2 mL de tampon acétate 1M pH 5,2

SPE cartouche HLB (60 mg)

Conditionnement de la cartouche : 5 mL de méthanol puis 5 mL d’eau Dépôt de l’échantillon

Rinçage du tube échantillon par addition de 3 mL d’eau

Rinçage de la cartouche avec 6 mL de méthanol/eau (10/90 V/V) 2% acide acétique (pH 3) 6 mL de méthanol/eau (10/90 V/V) 2% ammoniaque (pH 11)

6 mL de méthanol/eau (10/90 V/V) Séchage de la cartouche 1 min Elution avec 4 mL d’acétate d’éthyle

Evaporation à sec sous N2 à 40 °C Reprise par 2 mL d’acétate d’éthyle

SPE cartouche NH2 (aminopropylsilane) (200 mg)

Conditionnement de la cartouche : 3 x 5 mL d’acétate d’éthyle Dépôt de l’échantillon

Rinçage tube échantillon par addition de 2,5 mL d’acétate d’éthyle Elution par 2 mL d’acétate d’éthyle

Evaporation à sec sous N₂ à 40 °C

Dérivation

Réactif dérivant : MSTFA/NH₄I/DTE (1000/4/2) Ajout de 50 µL de réactif dérivant

1 h à 55 °C Analyse GC/MS

Figure 49. Protocole B : analyse de l’androstérone et de la DHEA

II.3.8 Analyse GC-MS

La séparation obtenue dans les conditions indiquées en II.3.1.b3 est la suivante (Figure 50):

140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 0 5 10 15 20 25 30

Figure 50. Séparation obtenue en chromatographie gazeuse

La séparation entre l’androstérone (A) et l’étiocholanolone (E) son diastéréoisomère n’a été possible que sur la phase HP-1, les phases HP-5 et DB-XLB ne le permettant pas. Dans le cas de la phase HP-1, l’élution des stéroïdes recherchés a lieu sur l’isotherme à 220°C (figure 50). La température initiale du four a été fixée à 150 °C pour éviter la formation d’un épaulement du pic tel que le montre le chromatogramme en figure 46, ce dernier obtenu avec une température initiale de 50 °C.

Ce double pic pourrait également être la conséquence du mode d’injection. En effet, la température d’ébullition du solvant d’injection (MSTFA) étant de 130 °C, l’injection à 280 °C suivie d’une condensation en tête de colonne avec une température du four de 50 °C permet habituellement une amélioration de la forme des pics et de la résolution. Le solvant est condensé sur quelques centimètres en début de colonne et joue le rôle de la phase stationnaire vis-à-vis des analytes qui sont piégés en tête de colonne⁴². Avec une température de four initiale de 150 °C, ce phénomène « d’effet solvant » n’a pas lieu. Il semble donc

17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 5000000 5500000 6000000 6500000 7000000 7500000 8000000 8500000 Time--> Abundance TIC: M7021907.D 16.90 18.95 19.88 ^20.39 20.70 24.29 min 1 NA diTMS 2 NE diTMS 3 NEA diTMS 4 A di TMS 5 E diTMS 6 DHEA diTMS 1 2 ³ 4 5 6 Température °C 20 °C/min 20 °C/min

Partie II

Analyse des métabolites de la nandrolone, de la DHEA et de l’androstérone dans l’urine

contradictoire que la suppression de l’effet du solvant par augmentation de la température initiale permette une amélioration du signal.

On peut cependant trouver une explication possible par les effets liés à l’injection. En effet deux modes sont possibles : l’injection directe, et la technique de « l’aiguille chaude ». Dans le premier cas l’aiguille est insérée dans le système d’injection et l’échantillon poussé par le piston immédiatement, ce qui peut avoir comme conséquence un début de vaporisation de l’échantillon. Dans le deuxième cas l’échantillon est rétracté dans le corps de la seringue avant injection, l’aiguille est introduite dans l’injecteur et laissée quelques secondes à chauffer, puis l’échantillon est injecté. Ceci permet de minimiser le phénomène d’évaporation fractionnée.

Dans le cas où la température initiale du four était de 50 °C, le mode d’injection utilisé était celui de l’aiguille chaude. On suppose que malgré les améliorations théoriques de ce mode d’injection, une évaporation fractionnée a toujours eu lieu et a conduit à deux condensations successives en tête de colonne, donnant un double pic sur le chromatogramme. Le passage à 150 °C de la température initiale conduit à une évaporation directe dans la colonne pour les deux fractions : on suppose un élargissement de la distribution de l’échantillon, qui, s’il a des conséquences sur la taille des pics chromatographiques, permet cependant une unification des deux pics.

La comparaison des deux modes d’injection n’a pas apporté d’amélioration de la répétabilité ou de la forme des pics, en conséquence c’est l’injection directe qui est utilisée.

Le réactif dérivant étant assez agressif, une détérioration de la colonne a lieu au fur et à mesure des injections. La qualité de la phase stationnaire est évaluée par des injections régulières d’octafluoronaphtalène (OFN) à 1 ng/mL avec lesquelles on effectue une détermination du rapport signal sur bruit.

Les spectres des analytes obtenus en mode Scan sont donnés en annexe 16. II.4QUANTIFICATION ET VALIDATION