Préparations des solutions étalons

a) Préparation des solutions étalons

Les solutions mères de NA, NE, NEA, NEd4 ont une concentration de 100 µg/mL dans le méthanol, celles de A et DHEA sont de 1000 µ g/mL. Elles sont conservées au réfrigérateur pendant une année au maximum. Les solutions étalons de NA, NE et NEA ont été préparées à partir de solutions de travail à 1 µg/mL dans le méthanol et les solutions étalons de A et DHEA à partir des solutions mères (tableau 12).

Tableau 12. Concentrations des solutions pour l’étalonnage en NA, NE, NEA, A, DHEAs

Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Etalon 4 Etalon 5 Etalon 6

NA (ng/mL de MeOH) 2,70 6,76 13,52 27,04 67,61 - NE (ng/mL de MeOH) 2,71 6,78 13,56 27,11 67,78 - NEA (ng/mL de MeOH) 2,74 6,86 13,72 27,44 68,59 - A (µg/mL de MeOH) 32 63 126 194 316 556 NaDHEAs (µg/mL de MeOH) ^{6 12 31 249 498 809}

Partie II

Analyse des métabolites de la nandrolone, de la DHEA et de l’androstérone dans l’urine

b) Préparation d’une urine blanche

La matrice urinaire joue un rôle primordial dans la répétabilité des résultats et leur justesse. De façon à tenir compte de cette matrice tout en s’affranchissant de la présence d’interférences sur les gammes d’étalonnage, une urine blanche est préparée à partir de l’urine d’enfants de moins de 3 ans, peu concentrée en hormones stéroïdiques et donc plus facilement purifiée de ceux-ci. Une hydrolyse enzymatique (β-glucuronidase d’Escherichia Coli) a donc été réalisée sur cette urine pendant 3 h à 55°C, suivie de trois extractions à l’éther. Un suivi du pH donne une indication de sa dégradation, une alcalinisation des urines étant signe d’activité de microorganismes ⁹.

Cette urine a été utilisée par la suite pour effectuer l’étalonnage : elle a été supplémentée par 50 µL des solutions étalons. On nommera ces échantillons étalons « urines dopées » dans le reste du manuscrit. A contrario, les urines de personnes saines et non dopées seront nommées « urines normales ».

Les solutions des métabolites de la nandrolone ont été étalonnées dans une gamme de concentration de 0,05 ng/mL à 1,35 ng/mL d’urine blanche, l’androstérone de 0,6 µ g/mL à 11,2 µg/mL d’urine blanche et la DHEAs de 0,1 µg/mL à 16,2 µ g/mL d’urine blanche. La DHEA étant présente principalement sous forme sulfatée dans les urines, un étalonnage en DHEAs a été choisi pour plus de rigueur vis-à-vis de l’étape d’hydrolyse. Les échantillons comme les étalons ont donc subi les mêmes étapes de préparation, le résultat est donné en µg/mL de NaDHEAs.

II.3.3 Echantillonnage

a) Choix du volume de prise d’échantillon

Le volume de prise d’essai souvent prélevé dans la littérature est de 5 mL ^{10, 24}, ou 10 mL ^{13, 34,}

35, 36

. Quelques travaux qui concernaient l’analyse d’androgènes plus concentrés ont abaissé ce volume à 2,5 mL ¹⁴ et 2 mL ¹¹, mais les résultats obtenus ont été mis en doute par l’AMA ³⁷ quant à leur représentativité.

Différents volumes de prise d’essai ont été testés comme suit : 2,5 ; 5 ou 10 mL d’urine normale ont été prélevés puis extraits par SPE sur phase HLB. Après hydrolyse enzymatique avec la β-glucuronidase d’E.Coli, les hydrolysats ont été extraits à nouveau sur phase HLB, puis sur phase C18. Ils ont ensuite été dérivés et injectés sur le GC-MS. Les chromatogrammes obtenus sont ceux de la figure 16.

Figure 16. Superposition du courant ionique total (TIC) des chromatogrammes de 2,5 ; 5 et 10 mL d’urine extraite

Le volume de prise d’essai de 2,5 mL d’urine a été retenu, constituant ainsi une avancée dans l’analyse de traces de métabolites de la nandrolone. Ceci correspond à un facteur de concentration de 50 (après extractions et reprise dans 50 µ L de dérivant), celui-ci étant suffisant pour l’analyse de traces tout en évitant une trop forte concentration des impuretés.

b) Précipitation des protéines

Il est d’usage dans le cas d’analyses de fluides biologiques de faire une précipitation avec un solvant afin d’éliminer les protéines. L’influence de cette précipitation sur la quantité de stéroïdes extraits et sur la pureté des échantillons a été testée par ajout de quantités croissantes d’acétonitrile sur une urine normale, tel que décrit dans la procédure ci-dessous :

à 2,5 mL d’urine normale sont ajoutés 0, 500, 1000, 2000 ou 3000 µL d’acétonitrile. Les échantillons sont ensuite maintenus à 6°C pendant une nuit. Un précipité se forme alors, d’autant plus important que la concentration en acétonitrile est élevée. Après centrifugation à 10 000 tours/min pendant 10 min, la phase surnageante est extraite sur cartouche HLB, hydrolysée par l’enzyme E.Coli, extraite sur cartouches HLB et Florisil, dérivée et analysée par GC-MS (figure 17). 14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50 18.00 18.50 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 16000 17000 18000 19000 20000 Time--> Abundance TIC: P6040512.D TIC: P6040527.D TIC: P6040533.D 10 mL 5 mL 2.5 mL NA NE NEA

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Analyse des métabolites de la nandrolone, de la DHEA et de l’androstérone dans l’urine

Figure 17. Superposition des chromatogrammes obtenus après ajout de différents volumes d’acétonitrile

Les chromatogrammes montrent que le bruit de fond et les abondances des analytes restent inchangés. En conséquence cette étape de précipitation n’a pas été retenue, cela représentant également un gain de temps puisque l’étape de centrifugation n’est alors plus nécessaire.

L’échantillonnage s’effectue donc comme suit : - décongélation des urines à température ambiante - pipetage de 2,5 mL du liquide surnageant

c) Choix d’un étalon interne

La présence d’un étalon interne s’avère nécessaire dans le cas de protocoles d’analyse multi-étapes comme c’est le cas pour les métabolites de la nandrolone, la DHEA et l’androstérone. L’étalon doit permettre la correction des variations éventuelles de chacune des étapes de l’analyse, assurant ainsi la robustesse du protocole. Deux possibilités sont envisageables : l’ajout de l’étalon en début de protocole, ou en fin avant l’étape de dérivation (figure 18).

16.50 17.00 17.50 18.00 18.50 19.00 19.50 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 Time--> Abundance Ion 405.00 (404.70 to 405.30): 70426010.D NEA NE NA Ion 405.00 (404.70 to 405.30): 70426011.D (*) Ion 405.00 (404.70 to 405.30): 70426012.D (*) Ion 405.00 (404.70 to 405.30): 70426013.D (*)

Ion 405.00 (404.70 to 405.30): 70426014.D (*)Sans ajout 500 µL 1000 µL 2000 µL 3000 µL NE ^NEA NA Extractions et hydrolyse

Echantillonnage Dérivation ^Injection _GC-MS

Correction de toutes les étapes

Correction de la dérivation et/ou de l’injection

Afin d’être de structure plus proche de celle des stéroïdes étudiés, l’étalon deutéré d4-noretiocholanolone (NE-d4) a alors été testé, la différence de 4 unités de masse le rendant facilement identifiable (annexe 10). Les groupements hydroxyles et cétones rendent possible la réaction de dérivation. NE-d4 a montré une bonne répétabilité après cinq injections dans la matrice urinaire (4 % de variation), ainsi il a été choisi comme étalon interne pour l’analyse des cinq stéroïdes, introduit en début d’analyse avant les extractions. Il permet de contrôler non seulement les extractions mais également le volume d’injection et la dérivation.