Les méthodes d’hydrolyse

La conjugaison des stéroïdes aux acides sulfurique et glucuronique lors des étapes du métabolisme de phase II dans le corps humain complique leur analyse dans les urines, ces stéroïdes étant présents sous trois formes : libre, glucuroconjuguée et sulfoconjuguée. Une étape de déconjugaison peut être nécessaire, mais ceci dépend de la méthode de détection utilisée.

a) Analyse directe sans hydrolyse

En utilisant la chromatographie de phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS), l’analyse des stéroïdes conjugués a pu être réalisée sans besoin de cliver les acides conjugués : elle a cependant été faite pour des stéroïdes à forte teneur dans les urines tels que la testostérone, la DHEA ou l’androstérone, atteignant 80 à 100 ng/mL en limite de détection¹⁶. Plus récemment la LC-MS/MS a été utilisée pour la mise au point d’un protocole d’analyse de la NA sulfate dans les urines, atteignant cette fois la limite de détection de 0,04 ng/mL ¹⁷.

La conjugaison augmentant la masse moléculaire des composés et favorisant l’établissement de liaisons hydrogène, l’utilisation de la GC-MS est difficile à cause de la hausse des températures d’ébullition des composés. Néanmoins une méthode a été mise en place avec cette technique pour l’analyse de l’androstérone glucuronide et d’autres glucuroconjugués sans hydrolyse, à l’aide d’une colonne chromatographique haute température¹⁸. Cette méthode, dont le but était de mettre à profit la bonne sensibilité et la résolution de la GC-MS, n’a cependant pas été appliquée aux sulfoconjugués, ni aux métabolites de plus faibles concentrations urinaires.

b) Hydrolyse enzymatique

Les hydrolyses enzymatiques sont effectuées en milieu aqueux et catalysées par des enzymes pouvant provenir de différentes origines : Escherichia Coli (bactérie intestinale), Helix Pomatia (escargot de Bourgogne), Helix Aspersa (escargot petit-gris), Patella Vulgata (mollusque) ou Ampullaria (escargot d’eau douce).

C’est depuis les années cinquante que ces enzymes sont utilisées dans le cadre de l’hydrolyse de stéroïdes glucuroconjugués. La majorité des travaux sont effectués avec les enzymes provenant de E. Coli ou H. Pomatia. Les activités de ces deux enzymes sont différentes : la première catalyse les réactions d’hydrolyse des glucuronides uniquement, tandis que la deuxième permet le clivage des glucuronides comme des sulfates : elles ont donc

respectivement des activités β-glucuronidase (E.Coli) ou β-glucuronidase et sulfatase (H.Pomatia).

Leur activité glucuronidase se mesure en unités Fishman, soit la quantité d’enzyme requise pour libérer 1 µ g de phénolphtaléine à partir de son glucuroconjugué, par heure, à 37 °C et à pH 5. L’activité sulfatase se mesure en unités représentant la quantité requise pour hydrolyser 1 µmol de sulfate de p-nitrocatéchol par heure, à pH 5 et à 37 °C.

Les pH optima pour les activités β-glucuronidase et sulfatase sont respectivement 7 et 5,2, ces conditions sont largement reprises dans plusieurs études (tableau 8). De même, les paramètres de température et de durée d’hydrolyse ont été très étudiés et varient selon le type d’enzyme utilisée.

Le tableau 8 récapitule de façon non exhaustive les conditions d’hydrolyse employées lors de l’analyse de NA, NE, NEA, DHEA ou A dans les urines :

Tableau 8. Relevé des différentes méthodes d’hydrolyse enzymatique utilisées dans la littérature

Année Analytes ^{Origine de} l’enzyme Place de l’hydrolyse par rapport à l’extraction 1 Durée (heures) Température (°C) ^{pH Référence} 1985 NA, NE, NEA H.Pomatia après 16 37 4,5 4 1996 DHEA, A E.Coli après 1 55 7 5 1997 NA, NE E.Coli après 1 50 7 6 1999 NA, NE H.Pomatia avant 15 52 5,2 7 1999 NA, NE E.Coli après 1 55 6,5 8 2001 DHEA, A E.Coli après 1 55 7 9 2001 NA, NE E.Coli avant 2,5 56 5,2 10 2001 NA, NE E.Coli avant 1 50 7 11 2001 NA, NE E.Coli après 1 56 6,5 12 2002 NA, NE E.Coli avant 1 52 6,5 13 2004 DHEA, A E.Coli après 1 55 7 14 2007 NA, NE E.Coli après 1 50 7 15

Lorsque la réaction est effectuée à pH 7, le milieu est tamponné par un tampon phosphate. Lors d’une hydrolyse à pH 5, le milieu est tamponné par un tampon acétate.

Les conditions généralement utilisées sont donc - β-glucuronidase E.Coli : 1 h, 50-55 °C, pH 7 - β-glucuronidase H.Pomatia 16 h, 37 °C, pH 5

Partie II

Analyse des métabolites de la nandrolone, de la DHEA et de l’androstérone dans l’urine

Il a été démontré ¹⁹ que l’hydrolyse enzymatique de stéroïdes avec H.Pomatia nécessite 24-48 h de temps d’incubation à 37-40 °C, bien que les mêmes résultats soient obtenus avec 3 h d’hydrolyse à 55 °C. L’utilisation d’enzymes est donc délicate, tant par les conditions d’hydrolyse à mettre en place que par les différents types d’enzymes existants. Une étude ²⁰ effectuée sur l’urine de bovins et visant à l’analyse de stéroïdes anabolisants a montré que l’enzyme H.Pomatia est très active pour la déconjugaison des glucuroconjugués quelle que soit la température (4-80 °C) et quel que soit le pH (4-7). En revanche les conditions de déconjugaison des sulfoconjugués sont plus sensibles : les valeurs optimales ont été obtenues à pH 5,2 et 52 °C, mais une variation de 10 °C ou de 0,5 unités pH peut conduire à une perte de 50 % de déconjugaison pour la même durée. Les paramètres d’hydrolyse sont donc à évaluer spécifiquement selon les types d’enzyme et la conjugaison des molécules à analyser.

c) Hydrolyse acide

L’hydrolyse des glucuro- et sulfoconjugués de stéroïdes peut également être effectuée par ajout d’acide dans le milieu, cette méthode étant employée depuis plusieurs décennies. Elle devait pallier au faible rendement d’hydrolyse enzymatique des sulfoconjugués. S’il s’agissait en premier lieu d’un ajout d’acide chlorhydrique, la méthode a été modifiée au fur et à mesure pour faire place à une solvolyse acido-catalysée, et plus précisément à une méthanolyse. Cette dernière implique l’utilisation d’une solution de chlorure d’acyle 1 mol/L dans le méthanol, produisant in situ de l’acide chlorhydrique. Des travaux récents⁵ ont montré la formation de HCl par ajout de triméthylchlorosilane en solution 1 mol/L dans le méthanol, l’avantage de cette réaction étant son efficacité dans le clivage des sulfoconjugués comme des glucuroconjugués. Le clivage des sulfoconjugués se fait donc comme suit, le principe étant le même pour les glucuroconjugués (R : squelette stéroïdique) :

Figure 12. Réaction d’hydrolyse acide Si Cl OH _{H Cl Si} O H Cl _{S O} O O O H R _{HO R} O H S O O Cl + + + +

Cette méthode a été employée pour l’hydrolyse de la DHEA et de l’androstérone ⁵ mais aussi pour NA, NE et NEA lors de la détermination de la répartition des conjugués de ces trois isomères ²¹. La méthode enzymatique reste néanmoins la plus répandue.