Approche non covalente

Cette technique a été développée par Mosbach et al ²⁷ en 1994 et est la plus répandue de nos jours. Elle est basée sur l’assemblage non covalent du monomère et de la molécule empreinte par des interactions spécifiques avant et pendant la synthèse du MIP, et par la recapture du substrat grâce à ces mêmes interactions non covalentes. La réussite de la capture du substrat dépend de la stabilité et de la force de ces interactions, celles-ci ayant des énergies de liaison plus faibles que les interactions covalentes (annexe 5). D’une façon générale les interactions non covalentes ont des cinétiques plus rapides que les interactions covalentes, ce qui est un

avantage recherché de cette approche. D’autre part la synthèse du MIP est également plus facile à mettre en œuvre. Elle est réalisée à partir des réactifs suivants : la molécule empreinte, le monomère, le réticulant, le solvant (dit porogène) et un amorceur radicalaire. Un polymère non imprimé (NIP, de l’anglais Non Imprinted Polymer) est généralement synthétisé en parallèle, dans les mêmes conditions mais en l’absence de molécule empreinte. La comparaison entre les deux permet d’évaluer la spécificité du MIP, le NIP n’adsorbant le substrat que par interactions non spécifiques.

a) Les interactions impliquées

Les interactions non covalentes les plus couramment mises en jeu sont les interactions électrostatiques, les liaisons hydrogène et les interactions dipolaires ce qui justifie la nécessité d’un substrat possédant des groupes fonctionnels polaires.

Les liaisons hydrogènes ont lieu entre une molécule accepteur de protons et une molécule donneur de protons²⁸. Les donneurs forts sont les acides carboxyliques et les phénols, ainsi que le chloroforme, et les accepteurs forts sont les amines primaires et secondaires. L’énergie d’interaction pour une liaison hydrogène est comprise entre 25 et 40 kJ/mol, ce qui représente la même force qu’une interaction de type dipôle-dipôle mais dix fois moins qu’une liaison ionique et soixante fois moins qu’une liaison covalente (annexe 5). L’enjeu dans le mécanisme de rétention des MIP est de générer une interaction de force suffisante pour maintenir les molécules pendant la phase de polymérisation, c’est pourquoi la multiplication des points d’interaction pour une même molécule est recherchée. On donne ici en exemple une interaction en six points obtenue entre l’alloxan (2) et le monomère (1) (figure 79).

Figure 79. Interaction en six points par liaisons hydrogène ²⁹

Les interactions dipolaires³⁰ regroupent les interactions dipôle - dipôle entre deux molécules possédant un dipôle permanent (éthers, nitriles) et les interactions dipôle - dipôle induit entre

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une molécule ayant un dipôle permanent et une molécule en acquérant un à l’approche de l’autre (les aromatiques). Ces interactions sont d’autant plus fortes que les molécules ont des moments dipolaires élevés.

Les interactions hydrophobes sont également souvent citées, celles-ci reposant principalement sur le squelette carboné des molécules empreintes. Elles sont un processus entropique spontané ²⁸ observé avec les molécules apolaires dans un environnement aqueux. Il s’agit d’une association en agrégats de ces molécules due aux propriétés de l’eau, liquide fortement associé.

b) Choix du monomère

Les synthèses de MIP requièrent l’introduction de groupements fonctionnalisés capables de complexer la molécule empreinte. Les monomères d’utilisation la plus répandue sont les acides acryliques ou méthacryliques, monomères acides, ainsi que les 2- et 4-vinylpyridine, monomères basiques (tableau 37). Ils peuvent créer des interactions électrostatiques ou des liaisons hydrogène.

Tableau 37. Monomères commercialisés et couramment utilisés

Catégorie Nom Structure Référence

Acide méthacrylique (MAA)

OH O 31 Monomères acides _{2-(méthacryloyloxy)éthyl} phosphate (MEP) ^O O O P OH OH O 32 Acrylamide NH₂ O 33 Monomères neutres _{2-hydroxyéthylméthacrylate} (HEMA) ^O O OH 34 2-vinylpyridine (2-VP) N 35 Monomères basiques 4-vinylpyridine (4-VP) ^N 36

empreintes. Une étude récente³⁷ portant sur l’extraction sélective du 4-hydroxytamoxifène dans les urines à partir d’un MIP synthétisé avec du MAA montre l’importance du choix du pH dans la rétention du substrat. La meilleure adsorption a lieu à pH 7 : en effet à ce pH le 4-hydroxytamoxifène est protoné (pKa 8,8) et le MAA anionique (pKa 5,5), d’où la formation d’une interaction électrostatique (figure 80). En revanche à pH 4, seul le substrat est protoné, le MAA étant sous forme neutre : le 4-hydroxytamoxifène n’est pas adsorbé sur le MIP. A pH 10 l’analyte, sous forme neutre, est retenu par interactions de Van der Waals sur la phase MIP.

O O

N⁺

H

Figure 80. Interaction ionique entre l’amine du 4-hydroxytamoxifène et le carbonate du MAA à pH 7

Cet effet du pH sur l’établissement de liaisons électrostatiques a également été mis en évidence dans un travail³⁸ ayant pour but l’extraction sélective de cinq triazines (atrazine, amétryne, cyanazine, prométryne et terbutylazine). La méthode d’évaluation du MIP étant l’HPLC (une colonne HPLC est remplie de particules de MIP et les molécules à analyser sont injectées dans un solvant adapté), c’est par le facteur de capacité que l’affinité du MIP pour les triazines a été démontrée. La rétention des molécules a diminué avec l’augmentation du pH à l’exception de l’amétryne. Ceci est expliqué par l’incapacité du MAA à former des liaisons hydrogène à un pH supérieur à 5, empêchant la rétention. L’amétryne, seule molécule ionisable aux pH testés et pouvant donc entrer en interaction avec le MAA par liaisons électrostatiques a été adsorbée sur le MIP à un pH supérieur à 5.

L’établissement de liaisons hydrogène avec le MAA est possible par le groupement acide carboxylique qui agit à la fois comme un accepteur et un donneur de protons. Les zones des molécules monomères les plus probables pour établir des liaisons hydrogènes ou des interactions électrostatiques ont été mises en évidence par les travaux de Farrington et al ³⁹ par modélisation moléculaire. Cette dernière permet le calcul des charges partielles sur chaque atome de la molécule : le MAA et la 2-vinylpyridine ont été étudiées par ce procédé.

L’intérêt de la modélisation repose sur l’analyse de la molécule empreinte par la même méthode afin d’établir les possibilités de liaisons. Farrington et al ont ainsi montré que la

MAA sur MIP 4-hydroxytamoxifène

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caféine peut former une liaison hydrogène par son groupement amine avec le proton du groupement hydroxyle du MAA, et que cette interaction est plus forte qu’avec la vinylpyridine.

Le MAA peut créer des complexes stables avec les molécules basiques, ainsi que l’ont montré Sellergren et al ⁴⁰ dans une étude consacrée à l’analyse par RMN de l’association entre la 9-éthyladénine et le MAA. A l’inverse la vinylpyridine interagit fortement avec les substrats acides, comme par exemple le diphénylphosphate (pKa 3,3) qui est sélectivement adsorbé sur un MIP synthétisé à partir de 2-VP ³⁵.

Une approche non covalente originale pour la capture du cholestérol a été mise au point par Asanuma et al ⁴¹ à partir de polymères synthétisés avec de la β-cyclodextrine. Cette molécule est un oligomère cyclique formé de sept entités glucose qui est capable de complexer le cholestérol dans un rapport 3 :1 (figure 81), la molécule empreinte étant trop grande pour être complexée de façon stable par une seule cavité β-cyclodextrine. Le cholestérol a été adsorbé avec une bonne sélectivité sur le MIP dans les deux conditions de synthèse testées, les interactions étant prouvées spécifiques par la moindre rétention observée sur le NIP. De plus l’existence du complexe d’inclusion β-cyclodextrine-cholestérol a été établie par RMN.

Figure 81. Synthèse d’un MIP à base de β-cyclodextrine pour la capture du cholestérol c) Choix du réticulant

Le réticulant a pour rôle d’assurer la rigidité de la structure polymère. Plus les sites de reconnaissance sont définis et rigides, moins il y a de pertes entropiques dues aux changements conformationnels des sites, ce qui est en faveur de l’affinité et de la sélectivité du MIP pour son substrat ¹³. Ceci est réalisé avec un fort pourcentage de réticulant (au

MA

β-cyclodextrine Complexe d’inclusion β-cyclodextrine-cholestérol

β-cyclodextrine

minimum 50 %). Généralement c’est l’éthylène glycol diméthacrylate (EDMA) qui est utilisé, molécule hydrophobe possédant deux groupements méthacrylate polymérisables, mais des réticulants ayant jusqu’à trois de ces groupements ont également été employés (tableau 38).

Un étude⁴² de l’influence du réticulant sur les capacités de reconnaissance du cholestérol en milieu aqueux a été publiée il y a quelques années. La stratégie a été de favoriser des interactions hydrophobes entre le réticulant ou le monomère et le cholestérol libre à doser par ajout d’une ou deux entités cholestérol au réticulant de façon à avoir une bonne interaction entre les deux. Dans ce but les réticulants présentés en figure 82 ont donc été synthétisés. Il a été observé que lorsque l’EDMA est remplacé par le glycérol diméthacrylate (tableau 38), la capacité de capture du cholestérol par le MIP diminue, passant de 17 à 8 mg/g. Il en est de même pour le NIP, passant de 12 à 3 mg/g et montrant ainsi la suppression d’interactions non spécifiques. Le meilleur MIP en terme de capacité de capture (MIP 43,7 mg/g, NIP 11,7 mg/g) et sélectivité est celui obtenu avec le réticulant possédant une entité cholestérol (figure 82). Lors de l’utilisation du réticulant possédant deux entités cholestérol, il était attendu une augmentation de la capacité de capture, ce qui n’a pas été le cas. Cet effet a été attribué au fait qu’une association entre les deux entités a pu avoir lieu, d’où une disponibilité des sites amoindrie pour le cholestérol libre.

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Tableau 38. Réticulants utilisés en synthèse de MIP

Nom Structure Référence

Ethylène glycol diméthacrylate (EDMA) O O O O 31

Propylène glycol diméthacrylate (PDMA) O O O O 25 Glycérol diméthacrylate O O O O OH 42 Triméthylolpropane triméthylacrylate (TRIM) O O O O O O 17 Divinylbenzène (DVB) 43 O O O O O OH O O O O O O O O OH O

Figure 82. Réticulants greffés avec une ou deux entités cholestérol ⁴²

La nature du réticulant a donc des conséquences importantes sur l’affinité du MIP envers le substrat, quand bien même les modifications structurales entre deux réticulants sont faibles. Cette constatation s’illustre dans les changements de facteurs de capacité et d’ordre d’élution

l’EDMA ou avec du PDMA²⁵. Les auteurs Cheong et al attribuent ceci à l’ajout de liberté rotationnelle et de flexibilité apporté par le carbone supplémentaire du PDMA.

Afin d’améliorer l’affinité du MIP pour un substrat (dérivés d’acides aminés), un réticulant trifonctionnel (TRIM) a été utilisé par le groupe de Mosbach¹⁷ en comparaison avec un MIP synthétisé avec l’EDMA. Ils ont noté d’excellentes propriétés de reconnaissance énantiomérique, bien que similaires entre les deux MIP, et une amélioration de la capacité lors de l’emploi du TRIM. Les MIP synthétisés avec le réticulant trifonctionnel semblent avoir des pores de plus grand diamètre et de plus grand volume, facilitant ainsi le transfert de masse.

d) Choix de la molécule empreinte

Les molécules empreintes sont classées en trois catégories par Sellergren¹³ :

- Catégorie 1 : ce sont les molécules faiblement à modérément polaires, interagissant généralement avec le monomère MAA par liaisons hydrogène. Une bonne recapture de ces molécules a été observée avec des solvants organiques et notamment l’acétonitrile, sa faible propension à faire des liaisons hydrogène le rendant non compétitif vis-à-vis du substrat. - Catégorie 2 : ce sont des acides ou bases de Brönsted, montrant une bonne affinité envers les monomères acides (MAA) ou basiques (2-VP) par un mécanisme d’échange d’ions.

- Catégorie 3 : ce sont les molécules ayant un caractère hydrophobe prononcé qui se traduit par une augmentation de la rétention lors de l’augmentation du pourcentage en eau du milieu de recapture. Lorsque le mécanisme de rétention dominant est un effet hydrophobe, une corrélation linéaire entre le logarithme du facteur de capacité (log k’) obtenu sur une colonne MIP et le logarithme du coefficient de partage n-octanol/eau (log P) des molécules empreinte est observée³⁸.

De manière générale, la molécule empreinte et la molécule à analyser sont les mêmes : on s’assure ainsi du bon positionnement des sites d’association et de la fidélité stérique de la cavité. Un lavage du MIP par solvant polaire²⁶ (méthanol) ou légèrement acidifié³¹ (méthanol/acide acétique) permet l’élimination de la molécule empreinte et la libération des sites spécifiques. Cependant, le relargage de molécule empreinte résiduelle lors d’une analyse, malgré les lavages, est une cause d’erreur de dosage, notamment lors de l’analyse de traces dans un échantillon⁴⁴. En conséquence, une molécule analogue peut être utilisée pour la synthèse du MIP: elle doit être de structure très proche de la molécule à doser et doit respecter le positionnement et l’orientation des groupements fonctionnels. Ainsi Möller et al ³⁵ ont préféré réaliser l’impression du MIP avec le ditolyl phosphate pour la capture du

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diphénylphosphate, la différence de structure étant lié à la présence d’un groupement méthyle sur les cycles benzéniques du ditolyl phosphate. Récemment³⁷ la synthèse d’un MIP dédié à la capture du tamoxifène a été effectuée sur le chlomiphène, analogue chloré de la molécule cible.

e) Choix du solvant porogène

Le choix du solvant de synthèse doit suivre deux critères¹ : il doit dissoudre la molécule empreinte, le monomère et le réticulant mais ne doit pas interférer avec la complexation. Dans le cas d’un mécanisme d’adsorption par liaisons hydrogène, le solvant le plus adapté est le moins polaire et le moins protique dans lequel les réactifs sont solubles. L’acétonitrile³⁷, le chloroforme⁴⁵ et le dichlorométhane³⁸ ont été souvent utilisés. Réaliser la polymérisation dans un bon solvant conduit à l’obtention d’un réseau relativement homogène, tandis que dans un solvant moins adapté la formation d’agglomérats est favorisée, conduisant à la génération de microsphères denses¹⁵. Le rôle du solvant de synthèse est l’obtention d’un réseau polymère poreux. Il est dit porogène si ceci se vérifie. La taille des pores dépend de la nature du solvant et du volume introduit dans le mélange de prépolymérisation.

Le solvant influence l’efficacité du MIP dans la mesure où il peut entrer en compétition avec le monomère ou la molécule empreinte dans le mélange de prépolymérisation, affaiblissant ainsi la force de l’interaction spécifique et sa sélectivité dans la reconnaissance des substrats. Les MIP à base de β-cyclodextrine⁴¹ pour la reconnaissance du cholestérol nécessitent par exemple l’emploi de DMSO, les polymères préparés avec de l’épichlorohydrine n’adsorbant pas le cholestérol. L’effet du solvant s’est vérifié dans l’analyse de la L-phénylalanine anilide¹⁵ : l’influence de neuf solvants de synthèse a été évaluée par chromatographie liquide en fonction du facteur de capacité k’. Les variations de sélectivité observées ont été corrélées avec la capacité des solvants à former des liaisons hydrogène δ_h (selon la classification d’Hildebrand et Scott, annexe 5), mais en revanche aucune corrélation avec les termes d’interaction dipole-dipole (δp) ou dispersion (δd) n’a été rapportée. Ceci montre bien la compétitivité du solvant lorsque le mécanisme d’association monomère-molécule empreinte est gouverné par des liaisons hydrogène.

.

En outre il a été observé¹⁵ que le solvant porogène influence l’apparence du polymère fraîchement synthétisé : en fonction du solvant, les MIP préparés à base de MAA et d’EDMA étaient transparents, translucides ou opaques.