a. Modèle in vivo d’injection unique de cocaïne
Dans un premier volet de cette étude, j’ai analysé l’effet de la cocaïne sur le niveau de phosphorylation de la protéine Mnk-1 dans le striatum de souris. J’ai montré que la phosphorylation de Mnk-1 (P-Mnk-1, Thréonine 197/202) est augmentée de manière rapide et transitoire dans les neurones striataux en réponse à une injection de cocaïne à 20 mg/kg.
(Figure 20A) Cette activation de Mnk-1 survient dès 5 minutes après l’injection de cocaïne
et revient à son niveau basal après 30 minutes (Figure 20B). Afin de déterminer si ERK est impliqué dans l’activation de Mnk-1, j’ai étudié l’effet du SL327, un inhibiteur de MEK. L’administration du SL327 abolit totalement l’activation de Mnk-1 par la cocaïne démontrant que celle-ci dépend de l’activation de la voie ERK. Accord avec l’implication de ERK, mes observations montrent que Mnk-1 et ERK sont activées dans la même sous-population neuronale du striatum (Figure 21).
Figure 20 : Cinétique d’activation de Mnk-1 en réponse à la cocaïne
(A) Images confocales illustratives du marquage de la protéine Mnk-1, sous sa forme phosphorylée (P-Mnk-1, Thr197/202), 10 minutes après une injection de solution saline (haut) ou de cocaïne (20 mg/kg) (bas). (B) Quantification du nombre de cellules P-Mnk-1 positives aux temps indiqués après une injection de solution saline ou de cocaïne (20 mg/kg). Données +/- SEM, n=4 ; effet du traitement, **p<0.01, ***p<0.001 ; effet du temps °°°p<0.001. Barre d’échelle : 50µM
Figure 21: Rôle de ERK dans l'activation de la protéine Mnk-1
(A) Images confocales illustratives du marquage de la protéine Mnk-1 sous sa forme phosphorylée (P-Mnk-1, Thr197/202), 10 minutes après une injection de solution saline ou de cocaïne chez des animaux prétraités avec le véhicule ou du SL327 (50 mg/kg). (B) Quantification du nombre de cellules P-Mnk-1 positives aux temps indiqués après une injection de solution saline ou de cocaïne (20 mg/kg) chez des animaux prétraités avec le véhicule ou du SL327 (50 mg/kg). Données +/- SEM, n=4 ; effet du traitement, ***p<0.001. Barre d’échelle : (A) 50µM, (B) 30µM
b. Activation in vitro du maillon pMnk-1/peIF4E
Dans un modèle in vitro, de cultures primaires de neurones striataux, la protéine Mnk-1 est activée par une co-stimulation pharmacologique des D1R et NMDAR (3 µM de glutamate en présence de 10 µM SKF38393 : stimulation G+S (Figure 22 A). Ce protocole est adapté d’un modèle in vitro de stimulation des neurones striataux, précédemment développé dans notre équipe, qui permet in vitro, de récapituler un certain nombre des réponses moléculaires induite par l’injection de cocaïne in vivo (Pascoli et al., 2011) Suite à son activation, pMnk-1 phosphoryle le facteur d’élongation de la traduction eIF4E (Knauf et al., 2001, Ueda et al., 2004b). L’administration du CGP57380, un inhibiteur de Mnk-1, conduit à une perte de l’augmentation de la phosphorylation d’eIF4E en aval de l’activation de Mnk-1 (Panja et al., 2009) L’application de ce composé dans les cultures primaires de MSN, diminue la phosphorylation d’eIF4E par la stimulation G+S (Figure 22B).
Figure 22: Activation du maillon pMnk-1/peIF4E dans un modèle in vitro de culture de neurones striataux
(A) Images illustratives prises en épifluorescence du marquage de la protéine Mnk-1, sous sa forme phosphorylée (P-Mnk-1, Thr197/202), dans des neurones striataux en culture 10 minutes après une stimulation contrôle (gauche) ou G+S (droite). (B) Détection par Western-Blot de la forme phosphorylée de la protéine eIF4E (Ser209 ) en réponse à une stimulation contrôle ou G+S avec ou sans prétraitement par le CGP57380 aux doses indiquées.
c. Modèle ex vivo (coll. Marc Dos Santos)
Cette partie du projet a été réalisée en collaboration avec Marc Dos Santos dans un modèle ex-vivo de tranches striatales obtenues à partir de cerveaux de souris adultes. Dans ce modèle, l’effet de la cocaïne est mimé par une stimulation G+S, identique à celle utilisée in vitro. L’application de cette stimulation permet de reproduire l’activation de ERK observée in vivo en réponse à la cocaïne. Les travaux de Marc Dos Santos ont également montré que cette stimulation reproduit ex vivo la pousse d’épine dendritiques rapide comme observé in vivo dans les MSN 1 heure après l’exposition à la cocaïne. Dans ce modèle, la protéine Mnk-1 est activée 20 minutes après l’application de la co-stimulation G+S (Figure 23). Nous avons ensuite souhaité analyser l’implication du maillon cytoplasmique ERK/Mnk-1 sur les changements de morphologie dendritique induits par la cocaïne. Les neurones sont marqués de manière stochastique sont marquées par un colorant lipophile, le DyI puis visualisés en microscopie confocale à fort grossissement (Heck et al., 2012, Heck et al., 2014)
L’application du CGP57380 inhibe l’augmentation de la densité d’épines dendritiques induite par la stimulation G+ S (Figure 24) démontrant l’importance de l’activation de Mkn-1 dans les changements morphologiques.
Figure 23: Activation de pMnk-1 dans un modèle ex vivo de tranches de striatum (A) Images illustratives du marquage de la protéine Mnk-1, sous sa forme phosphorylée (P-Mnk-1, Thr197/202) dans des tranches de striatum, 20 minutes après une stimulation par le DMSO ou de type G+S. (B) Quantification du nombre de cellules P-Mnk-1 20 minutes après une stimulation par le DMSO ou de type G+S. . Données +/- SEM, n=4 ; effet du traitement, **p<0.01. Barre d’échelle : 10µM
Figure 24: Effet de l‘inhibition de pMnk-1 sur l’augmentation de la densité d’épines dendritiques induite par une stimulation G+S
(A) Projection maximale d’un empilement d’images confocales d’un fragment dendritique visualisé par un marquage au DyeI 20 minutes après une incubation en absence (contrôle) ou présence de la co-stimulation G+S sur des tranches prétraitées au CGP57380 ou au DMSO. (B) Quantification de la densité d’épines dendritiques 20 minutes après une stimulation par le DMSO ou de type G+S sur des tranches prétraitées au CGP57380 (ou au DMSO. Données +/- SEM (n=3) *p<0.05. Barre d’échelle : 10 µm
Cette étude montre pour la première fois que la protéine Mnk-1 est activée in vivo en réponse à la cocaïne en aval de l’activation de ERK. Les données obtenues in vitro indiquent que Mnk-1 est impliquée dans la phosphorylation d’eIF4E en réponse à une stimulation par le
CONTROLE g+S DMSO CGP ** Ep in es p o u r 10 µ m d e d en d ri te
A
.
B
.
glutamate et le composé CGP57380 utilisé à 10 µm inhibe effectivement l’activité de Mnk-1. Il serait intéressant d’analyser l’effet de la cocaïne sur la phosphorylation d’eIF4E in vivo et d’établir le rôle de Mnk-1 dans ce mécanisme. Nos données suggèrent très fortement que la voie ERK est impliquée dans des régulations traductionnelles au travers de l’activation de la kinase Mnk-1. Les données obtenues dans le modèle de tranches aigues de striatum montre que l’activation de cette voie est importante pour les changements morphologiques rapides induits par la co-stimulation des D1R et des récepteurs au glutamate. In vivo, l’activation de Mnk-1 en aval de ERK pourrait ainsi jouer un rôle central dans la pousse et le remodelage des épines dendritiques observé en réponse à la cocaïne. Etant donné le rôle de ce module dans la régulation de l’expression de Arc dans l’hippocampe, il serait intéressant d’analyser l’effet de l’inhibition de Mnk-1 sur les réponses morphologiques induites par la cocaïne. Cette étude suggère donc l’implication d’un substrat cytoplasmique de ERK dans la régulation de la plasticité structurelle induite par les drogues. Cette voie de régulation indépendante de la transcription pourrait rendre compte de l’implication de ERK dans des processus cellulaires rapides importants pour la mise en place de la plasticité synaptique.
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
La protéine Arc joue un rôle central dans les processus de plasticité neuronale qui sous-tendent l’apprentissage et la mémoire (Shepherd and Bear, 2011). Cet IEG, induit dans de nombreux paradigmes comportementaux, est essentiel pour la mise en place de la plasticité synaptique à long terme et la consolidation de la mémoire. S’il a été montré que l’expression de Arc est augmentée dans le striatum et le cortex en réponse à la cocaïne, les mécanismes impliqués dans sa régulation ainsi que son implication dans les adaptations neuronales induites par cette drogue d’abus restent peu documentés.
Mon travail de thèse visait à caractériser précisément le profil et les modalités de l’induction de Arc par la cocaïne dans le striatum et étudier son rôle dans les réponses moléculaires et comportementales induites par cette drogue. Dans un premier volet de cette étude, j’ai analysé le profil d’induction de Arc en réponse à l’administration de cocaïne ainsi que les voies de signalisation impliquées au sein des MSN. Notre étude a montré que l’expression de Arc est augmentée rapidement et transitoirement dans le striatum après une injection unique de cocaïne. J’ai également établi que cette induction dépend de la stimulation concomitante des D1R et NMDAR ainsi que de l’activation de la voie ERK. De manière inattendue, l’analyse de la localisation subcellulaire de la protéine Arc a révélé que la cocaïne induit une accumulation rapide et massive de Arc dans le compartiment nucléaire des MSN. Au sein du noyau, Arc est exprimée dans les zones actives de transcription où elle est colocalisée avec les histones H3 sous leur forme phosphorylée (pH3). In vitro, dans des cultures de MSN, j’ai montré que la surexpression de Arc diminue la phosphorylation des histones H3 induite par le glutamate indiquant qu’elle réprime des mécanismes épigénétiques induits par l’activité neuronale. Enfin, l’utilisation d’un modèle génétique d’invalidation de Arc, les souris knock-in Arc-d2EGFP, m’a permis d’établir que l’abolition de l’expression de Arc entraknock-ine une décompaction de la chromatine associée à une augmentation de l’activité de la RNA Pol-II. La perte d’expression de Arc rend les animaux hypersensibles à la cocaïne et favorise le développement d’altérations comportementales à long terme induites par de faibles doses de cocaïne (Figure 25).
Ce travail apporte la première démonstration d’un impact de la cocaïne sur l’adressage de Arc vers le noyau. L’entrée massive et rapide de la protéine dans ce compartiment suggère qu’elle est impliquée dans des évènements nucléaires induits par la cocaïne, un rôle qui n’avait jamais
été envisagé à ce jour dans le contexte des réponses aux drogues. L’ensemble des données obtenues in vivo et in vitro indiquent effectivement que l’expression de Arc influence l’organisation de la chromatine et la transcription. Enfin, ce travail permet d’établir un rôle de Arc dans les réponses comportementales induites par la cocaïne en démontrant que son expression tend à limiter le développement de la sensibilisation locomotrice. L’ensemble de nos résultats indique que l’induction rapide et transitoire de Arc dans le noyau contribue au remodelage de la chromatine et aux réponses moléculaires et comportementales induites par la cocaïne. Nos données sont en faveur d’un rôle répresseur de Arc sur ces réponses et suggèrent qu’elle participe à une forme de plasticité homéostatique en réponse à l’exposition à la cocaïne.