Résultats et interpretation

Test QuickVue Influenza A+B -Quidel-

Figure 20 : Résultat positif pour le virus type A (A+) et type B (B+)

(Test QuickVue Influenza A+B -Quidel-) [77]

Si les antigènes (NP) de la grippe A ou B sont contenus dans l'échantillon extrait, une ligne test rose à rouge apparaîtra avec une ligne de contrôle bleue sur la bandelette indiquant un résultat positif.

La ligne test pour la grippe A ou B apparaîtra à des emplacements spécifiques distincts sur la même bandelette test.

Si les antigènes du virus A ou B ne sont pas présents, ou sont présents à des taux très faibles, seule la ligne de contrôle bleue apparaîtra.

Maintenir la bandelette test la flèche pointée vers le bas. Si :

-La ligne rouge se situe au-dessus de la ligne de contrôle, le résultat du test est positif pour le type A.

-La ligne rouge se situe au-dessous de la ligne de contrôle, le résultat du test est positif pour le type B. (Fig.20)

Test EZ Flu A+B Directigen -Becton Dickinson-

Figure 21 : Résultat positif pour le virus type A

Un résultat positif pour l’influenza A apparaît sous forme de ligne rouge pourpre à la position "T" de test et à la position "C" de contrôle dans la fenêtre de lecture de Directigen EZ Flu A ( Fig.21).

Un résultat positif pour l’influenza B apparaît sous forme de ligne rouge pourpre à la position "T" de test et à la position "C" de contrôle dans la fenêtre de lecture de Directigen EZ Flu B [76].

2.3.1.4. Autres

La détection rapide d’antigènes d’Influenza peut également concerner la recherche de neuraminidase. La technique actuellement commercialisée (ZstatFlu -Zymetex Inc-) repose sur une méthode non immunœnzymatique, mais enzymologique sans intervention d’anticorps monoclonaux. Dans le cas de ce test, c’est l’activité intrinsèque de la NA virale elle-même qui est mise en évidence. Un substrat étroitement spécifique des virus grippaux est mis en contact avec le prélèvement. S’il y a des virus grippaux, ce substrat synthétique se loge dans le site catalytique de la NA. Grâce à un chromogène lié au substrat synthétique, la présence de ce dernier, et par conséquent de NA virale (Virus A ou B) dans un prélèvement, est mise en évidence par réaction colorimétrique par clivage du chromogène. Toute résultat positif se traduit par une coloration bleue due à la précipitation du chromogène libéré (Fig.22) [1, 78].

Figure 22 : Résultat positif pour le virus type A ou type B

Tableau 3 : Tableau comparatif de quelques exemples de tests de détection

antigénique rapide pour le diagnostic des virus Influenza A & B [8, 50, 62, 74, 75, 79]. Test -Firme- Durée (mn) Sensibilité* (%) Spécificité** (%) Remarques Directigen Flu A -Becton Dickinson- 15 91 95 Détecte uniquement l’influenza de type A Directigen A/B -Becton Dickinson- 15 86.2 90.7 Détecte A et B (test différentiel entre A et B) Directigen EZ A/B -Becton Dickinson- 15 85.8 99.4 Détecte A et B (test différentiel entre A et B) Quick Vue -Quidel- 10 79.2 82.6 Détecte A et B (test différentiel entre A et B) ZstatFlu -Zymetex Inc- 30 71 83 Détecte A et B (sans distinction entre les deux) *, ** ; pour l’Influenza type A uniquement en comparaison avec la culture cellulaire.

Sensibilité : c’est le pourcentage de ―vrai cas de grippe‖ détecté comme positifs

par un test.

Spécificité : c’est le pourcentage de ―vrai cas de non-grippe‖ détecté comme

Rq : c’est ce qui explique que ce que l’on gagne en sensibilité on le perd en

spécificité.

N.B. :

La comparaison des sensibilités et spécificités des trousses commerciales qui sont publiées par les manufacturiers dans leurs monographies requièrent de la prudence puisque leurs études ont été effectuées avec des groupes de patients qui diffèrent et dont les spécimens variables ont été prélevés à différents moments après le début des symptômes [55].

Ces méthodes sont rapides et le niveau d’information est, pour la grippe, le type viral A ou B (absence de distinction entre la grippe saisonnière et la grippe aviaire) [1, 8, 62, 68, 70, 80].

La rapidité de mise en œuvre de ces tests en font des tests de détection de l’antigène de l’influenza de type A adapté au diagnostic d’urgence, en particulier face à une suspicion de grippe aviaire chez l’homme due au virus A/H5N1 [74]. Les performances de ces tests dépendent de la charge en antigène et ne sont pas nécessairement corrélées aux résultats obtenus en culture cellulaire pour le même échantillon [73, 74], l’antigène présent dans l’échantillon peut être inférieure à la limite de détection du test [50, 70].

En général l’utilisation des tests de détection rapide n’est pas recommandée par l’OMS pour le diagnostic de la grippe aviaire A/H5N1. Ces tests ne doivent pas être utilisés comme seuls fondements du traitement ou autres décisions de gestion, surtout que seules quelques firmes ont fait des évaluations concernant la réactivité de leurs Kits vis-à-vis de certains virus influenza d’origine animale. C’est pourquoi, tous les résultats négatifs par ces tests doivent être confirmés par culture cellulaire ou RT-PCR car les résultats négatifs n’excluent pas une infection par un virus Influenza.

En fait, les valeurs prédictives positives et négatives dépendent étroitement de la prévalence. Au tout début de l’activité, les VPN sont plus élevées et les VPP plus faibles, les résultats faussement positifs seront alors plus probables.

Pendant un pic d'activité, les VPP seront plus élevées générant peu de faux positifs pendant que les VPN seront un peu plus faibles [62, 75, 80, 81].

2.3.2. Détection antigénique du type et du sous-

type grippal A/H5N1

2.3.2.1. Technique d’Immunofluorescence A- Généralités

Les prélèvements à analyser (obtenus dès que possible après le début des symptômes -moins de 48 voire 24 heures- car le nombre de cellules infectées présentes diminue au fur et à mesure que l’infection évolue) ne doivent donc pas être congelés et doivent être acheminés le plus rapidement possible au laboratoire de virologie à + 4 °C.

Il est préférable de pratiquer l’épreuve d’IF sur des cultures cellulaires inoculées car cela permet d’amplifier tout virus présent [1, 51].

Cette méthode permet la mise en évidence des antigènes viraux au sein des cellules infectées à partir de prélèvements cliniques ou de cultures cellulaires. La technique de base des tests d’IF consiste à colorer les échantillons fixés sur les puits d'une lame porte-objet au moyen d’anticorps à marqueurs fluorescents et à les observer en microscopie à fluorescence [50].

En immunofluorescence directe (IFD), la présence d’antigènes viraux est visualisée par un mélange d’anticorps monoclonaux spécifiques des types grippaux A et B et par un mélange d’anticorps monoclonaux spécifiques du sous-type grippal A/H5 marqués par un fluorochrome.

Dans le cas de l’immunofluorescence indirecte (IFI), ce n’est pas l’anticorps spécifique des antigènes viraux qui est couplé à un fluorochrome, mais un anticorps anti-espèce. (Ex : anticorps monoclonal de souris spécifique du sous-type grippal A/H5 et conjugué IgG anti-souris marqués FITC -Isothiocyanate de fluorescéine-).

Cette méthode nécessitant une étape supplémentaire est un peu plus longue, mais elle permet d’augmenter la sensibilité de la détection.

Tableau 4 : tableau comparatif entre l’IF et la culture cellulaire

Sensibilité et spécificité de l’IF en comparaison avec la culture cellulaire

[15].

Sensibilité 70-100%

Spécificité 80-100%

B- Méthodologie

Cette épreuve doit être effectuée conformément aux instructions figurant dans la trousse de réactifs OMS [51].

Les cellules épithéliales sont débarrassées de tout mucus contaminant par centrifugation, puis fixées et colorées avec les anticorps monoclonaux spécifiques. Les cellules de l’épithélium respiratoire infectées présentes dans un prélèvement clinique sont très fragiles et facilement endommagées : elles doivent donc être gardées au froid sur de la glace au cours de l’analyse et ne pas être centrifugées à plus de 500 g.

Des lames témoins avec des cellules infectées par les sous-types A/H3 et A/H1 (et, lorsqu’il y en a, avec des cellules infectées par le sous-type A/H5) et des

cellules non infectées doivent être jointes pour permettre un contrôle approprié des anticorps monoclonaux et du conjugué et aider à l’interprétation.

C- Interprétation des résultats

La coloration spécifique doit être une fluorescence vert pomme intracellulaire intense. On peut observer une fluorescence dans le noyau et/ou le cytoplasme. Il est important de veiller à ce que la densité cellulaire soit suffisante. La présence d’une ou plusieurs cellules intactes montrant une fluorescence intracellulaire spécifique peut être acceptée comme un résultat positif (Fig.23).

Figure 23 : Microphotographie d’une immunofluorescence indirecte

réalisée sur cellules infectées par le virus A/H5N1

Les anticorps monoclonaux disponibles dans le commerce pour le sous typage des virus grippaux A/H1 ont montré des réactions croisées avec les sous-types A/H5, les tests de confirmation doivent être effectués au moyen de l’anticorps monoclonal fourni dans la trousse OMS qui contient un pool d’anticorps

monoclonaux spécifiques du type A/H5, un pool dirigé contre le type A et B et un pool spécifique de A/H1 et A/H3 [15, 51].

Les résultats de l’IF sont rapidement disponibles (1 à 2 h). Mais malgré sa simplicité apparente et sa très large diffusion, l’IF nécessite beaucoup de savoir-faire et des manipulateurs expérimentés pour la lecture et l’interprétation [60].