Cette méthode de référence pour le diagnostic de laboratoire, présente l’avantage de permettre l’isolement de la souche, son identification, sa caractérisation antigénique et génétique approfondie, ainsi que l’étude de la sensibilité aux antiviraux et la préparation de vaccins. Elle est particulièrement indiquée dans le cas où les prélèvements sont pauvres en virions ou en antigènes viraux, elle permet d’améliorer la sensibilité de la détection directe car elle représente un moyen efficace d’amplification de la quantité d’antigènes viraux initiale [10, 45, 78], permettant l’obtention d’un matériel infectant qui peut servir aussi à l’élaboration d’anticorps spécifiques, Elle présente, en outre, l’avantage de permettre l’archivage des souches -virothéque- (par congélation) pour des études ultérieures [23].
La culture cellulaire, malgré sa lenteur (donne des résultats en 2 à 10 jours), reste une méthode très sensible. Actuellement la culture cellulaire est considérée comme étant le Gold standard pour le diagnostic d’une infection par le virus A/H5N1 [10, 24, 51, 71].
2.4.1. Systèmes cellulaires utilisés
2.4.1.1. Isolement du virus sur Œuf de poule embryonné
L’œuf de poule embryonné a longtemps été le meilleur moyen d’isoler les virus grippaux, car il présentait de nombreux avantages, dont la sensibilité et le faible coût [57].
Actuellement, ce système est délaissé au profit des cultures sur monocouches cellulaires particulièrement pour le H5 et le H7 qui sont létaux pour les embryons de poulet [4, 5, 57].
2.4.1.2. Isolement du virus sur Cellules de rein de chien MDCK
En effet, l’inoculation aux cellules canine MDCK est devenue la méthode de référence pour l’isolement des virus grippaux. Cette lignée continue de rein de chien présente l’avantage d’être cultivée facilement et donne de très bons rendements et permet des isolements faciles des virus grippaux [57].
Contrairement aux autres souches du virus grippal A, le virus grippal A/H5 poussera également dans d’autres lignées cellulaires courantes telles les cellules Hep-2 et RD.
Les méthodes classiques de cultures cellulaires en laboratoire doivent être suivies pour la multiplication des cultures cellulaires, l’inoculation des échantillons et la récolte des cellules infectées pour l’épreuve d’immunofluorescence ou du surnageant de culture pour l’hémagglutination et l’inhibition de l’hémagglutination.
La multiplication des cellules est effectuée dans un milieu stérile, sur un support plastique auquel elles adhèrent pour former une couche monocellulaire [60]. Généralement la confluence du tapis cellulaire est atteinte en 24 à 48h [10].
Figure 24 : Tapis de monocouche cellulaire (MDCK) vue au microscope
inversé.
Les conditions de culture les plus favorables ont été bien définies : milieu sans sérum (pour éviter l’inhibition de la Trypsine), adjonction de trypsine pour cliver le précurseur de l’HA et faciliter la diffusion du virus, inoculation par centrifugation du prélèvement, l’incubation se fait à 35°C en atmosphère humide à 5% de CO2 [12, 82].
2.4.2. Détection virale
Comme les autres virus grippaux; le virus A/H5N1 ne donne pas d’effet cytopathique spécifique. Sa détection et son identification peuvent être fait à partir des cellules en culture :
-Par hémagglutination des surnageants de culture cellulaire suivie d’une analyse antigénique (sous-typage) par IHA au moyen d’un panel d’immunsérums de référence. On peut ainsi distinguer les sous types et dans un sous type, les variants.
-Par IF avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine NP.
-D’autres méthodes comme la RT-PCR ou éventuellement l’IF, peuvent aussi être utilisées pour différencier les sous-types de grippe A.
-De même, il est possible de caractériser la NA en utilisant une réaction d’inhibition de cette activité à l’aide de sérum spécifique (anticorps monoclonaux de spécificité connue) [12, 15, 51, 57, 60, 83].
2.4.2.1. Observation de l’effet cytopathique
Pour juger du résultat de l’isolement, on observe les cultures sous le microscope inversé : les cellules infectées sont détruites et les cultures dégénèrent rapidement.
On peut gagner du temps en éprouvant le surnageant de culture dés le deuxième jour suivant l’inoculation, pour y rechercher l’HA –le virus présent agglutine efficacement les globules rouges et le titre obtenu est souvent suffisant pour permettre l’identification directe par IHA–, ou en grattant des cellules pour y détecter des protéines virales par IF. Lorsque la quantité de virus présente dans le prélèvement est faible, il arrive que l’infection ne se manifeste que tardivement et il est recommandé d’observer le système tant que les cellules survivent, en ajoutant du milieu frais si nécessaire pour compenser la quantité retirée pour les épreuves d’hémagglutination. Il est possible que la présence d’anticorps en faible quantité dans le prélèvement ralentisse l’activité du virus
viables jusqu’à 10 ou 12 jours et les isolements sont encore possibles jusqu’à cette limite [10].
2.4.2.2. Hémagglutination
Le virus grippal possède la capacité d’agglutiner les hématies de différentes espèces animales de façon quantitative et visible macroscopiquement. L’agglutination est due à l’attachement des molécules d’HA par leur «site récepteur» aux acides sialiques des hématies, qui sont portés par des sialoglycoprotéines (glycophorines) et des sialolipides (gangliosides).
L’HA est un antigène de surface de la particule virale et l’évaluation de sa quantité permet d’apprécier celle du virus grippal dans une suspension ainsi La découverte de la propriété à hémagglutiner que possèdent les virus grippaux a fourni aux virologistes un outil simple et efficace de détection puis de titrage. L’hémagglutination du virus grippal peut être inhibée par des anticorps spécifiques de la souche virale, mais aussi par des inhibiteurs non spécifiques, que l’on retrouve dans le sérum de la plupart des espèces animales. Ce sont des glycoprotéines (ou des lipoprotéines), plus ou moins analogues aux récepteurs spécifiques du virus, qui se trouvent sur la membrane des hématies ou des cellules sensibles. Il convient donc de se débarrasser auparavant des inhibiteurs non spécifiques par un prétraitement du sérum au RDE (filtrat de culture de Vibrio cholerae) ou au trypsine/périodate, selon l’espèce. On doit aussi éliminer des sérums les agglutinines naturelles pour les globules rouges par une étape d’adsorption [1, 24, 51].
Principe de l’hémagglutination (Titrage des antigènes)
Après mise en contact des suspensions virales (une série de dilution) avec une concentration standard d’hématies, observer leur sédimentation après 60 ou 90 min à température ambiante. Puis, lire le titre de l’antigène [10, 24].
Résultats et interprétations
Le titre de l’antigène est indiqué par la dilution du virus la plus élevée donnant encore une hémagglutination complète est considérée comme étant le point final de la réaction qui correspond à une « unité » hémagglutinante.
N.B.
: Il ne s’agit pas d’une vraie unité mais d’une concentration qui porte mal son nom : une « unité » hémagglutinante est la concentration pour laquelle un volume V de suspension virale agglutine un volume V de suspension d’hématie à 0,5% ou 1% selon le protocole employé [10, 24].2.4.3. Identification du type, sous-type et variant
Viral
2.4.3.1. Inhibition de l’hémagglutination
Principe
L’antigène est dilué de façon à titrer 4 unités hémagglutinantes (la dilution à appliquer est obtenue en divisant par 4 le dénominateur du titre défini précédemment), puis on procède à une série de dilution. L’antigène sera mis en présence de sérums de référence dirigés contre le virus soupçonné. Laisser une heure à la température ambiante, après mise en contact avec les hématies. On peut mettre une nuit à +4°C : la lecture n’en sera pas affectée.
La technique du coulage facilite cette lecture. Pour cela, mettre la plaque en position quasi-verticale pendant quelques minutes.
Lire les titres des sérums et déterminer le type du virus [10, 28].
Résultats et interprétations
Le point final de la réaction de l’IHA est la dernière dilution d’immunsérum qui inhibe complètement l’hémagglutination. Le titre est exprimé sous la forme de l’inverse de la dernière dilution. L’identification de l’isolement s’effectue en comparant les résultats de cet isolement inconnu à ceux du témoin antigénique. On considère qu’un isolement appartient à un sous-type grippal A précis si le titre IHA spécifique de sous-type est au moins égal à quatre fois le titre obtenu avec l’autre immunsérum.
L’IHA est la méthode de référence, elle est simple, peu coûteuse et permet la détermination du type, sous-type et même du variant en cause. Le choix des antigènes de référence est étroitement lié à la connaissance des souches en circulation [10].