Résultats et discussion

La production et la purification d’endocan recombinant ont été entreprises pour mener à bien plusieurs projets. Dans le cadre des travaux de thèse, l’endocan ainsi obtenu allait pouvoir être utilisé pour étudier les interactions avec d’autres molécules ou pour développer des essais visant à caractériser ses fonctions. Dans le même temps, l’endocan purifié pouvait constituer une source de chaînes de DS d’endocan, amenées à être caractérisées ou fractionnées afin d’obtenir une librairie oligosaccharidique de type DS. Dans le cadre du développement d’un kit de dosage d’endocan, le PG utilisé comme standard de référence était également nécessaire. De même, une production conséquente d’endocan était nécessaire pour

Figure 1: Système de production en bioréacteur CELLine 1000

Le système de production CL1000 (CELLine 1000) développé par Integra Biosciences a été conçu principalement pour la production d’anticorps monoclonaux. Le principe du bioréacteur est très simple. Le système se compose de deux compartiments distincts, séparés par une membrane semi- perméable (10 kDa). Les biomolécules produites sont ainsi retenues dans le compartiment inférieur (qui contient également la masse cellulaire). En revanche les métabolites produits par les cellules diffusent dans le compartiment supérieur, compartiment qui sert également de réserve nutritive (milieu de culture). L’apport en oxygène se fait par la surface inférieure qui est directement en contact avec les cellules pour une meilleure oxygénation des cellules vouées à croître de manière très dense.

Gain de temps Réduction des risques de

contamination 1.5 heures minimum (pour 2 passages) 20 à 30 min / CL1000 (pour 2 passages) Temps de manipulation / semaine Économie énorme en consommables

Flasks, Pipettes, Tubes à centrifuger, etc… Très faible

Consommables

Réduction importante du volume de récolte à purifier

Gain de place dans les incubateurs

équivaudrait à 1,6 L de surnageant

soit 2 passages de 8 flasks 175 cm2 40 ml / CL1000 (2 passages) Volume de surnageant récolté / semaine Concentration en endocan x 40 environ 5 µg/ml environ 200 µg/ml Concentration estimée en Endocan Suspension en flasks 175 cm² ou spinners CL1000 Méthode de production Optimisation liée à l’utilisation des CL1000 Production d’endocan en flasks ou spinner Production d’endocan en CL1000

Figure 2: Tableau comparatif des différents modes de production d’endocan

Dans le but d’optimisations, la production d’endocan a été mise au point en flasks, spinner, et bioréacteur CL1000. La production en protéines, les volumes à traiter, le temps de manipulation, l’utilisation de consommables ont été estimés et retranscrits dans ce tableau.

réaliser des essais in vivo chez l’animal très consommateurs de protéines recombinantes. Ainsi, en utilisant le protocole de production mis en place pour les anticorps et initialement developpé chez Endotis Pharma par Estelle Adam (Adam et al. En préparation) et en adaptant la purification d’endocan mise en place par Béchard et al. (2001), nous sommes passés d’une production de quelques centaines de microgrammes à plusieurs milligrammes d’endocan recombinant (Figure 1).

Pour chaque bioréacteur, les conditions optimales de production (ensemencement, temps entre chaque passage, viabilité) ont été évaluées (données non montrées). Si la quantité de cellules par millilitre de milieu consommé est uniquement prise en compte, les conditions d’ensemencement sont identiques pour les trois moyens de cultures. En revanche, pour les CL1000, si l’on prend en considération uniquement le compartiment cellulaire qui compte pour 20 mL alors que l’ensemble du bioréacteur utilise 800 mL, alors dans ce cas, l’ensemencement peut être considéré comme quarante fois plus important pour une CL1000 que pour un flask ou un spinner. Une comparaison sur la rentabilité de ces trois moyens de production a été faite (Figure 2). De façon identique à ce qui vient d’être expliqué, la production d’endocan apparaît quarante fois plus importante pour une CL1000 si seul le compartiment cellulaire est pris en compte. Cependant, rapporté au nombre de cellules totales et au volume de milieu consommé, le taux de production est identique. L’énorme avantage du bioréacteur CL1000 est lié au fait que les volumes à traiter (purifier) sont quarante fois moins importants. Cela est un avantage pour le temps de purification et par conséquent pour l’intégrité du PG. Concernant les avantages techniques, la CL1000 est également favorable à un gain de place dans les incubateurs, un gain de temps, une réduction des risques de contamination et une économie très importante sur du long terme (une CL1000 peut être utilisée pendant 6 mois). L’ensemble de ces travaux fait l’objet d’un manuscrit en préparation :

Adam E., S. Sarrazin, C. Landolfi, V. Motte, P. Lassalle and M. Delehedde. (Fin de rédaction) "Efficient long-term and high yielded production of a recombinant proteoglycan in eukaryotic HEK293 cells using a membrane-based bioreactor."

Concernant la purification, le protocole (Béchard et al., 2001) a principalement été conservé. Il est constitué de deux principales étapes de chromatographie. Tout d’abord, une étape d’échange d’anions est réalisée. Figure 3A le chromatogramme d’une élution de colonne DEAE-sephacel est présenté. Pour avoir également travaillé avec des gradients de NaCl, l’élution de l’endocan débute à environ 0,4 M NaCl (données non montrées). L’élution

Figure 3A: Première étape de la purification d’endocan par chromatographie échangeuse d’anions

Sur une colonne C10/10 (5 mL de résine DEAE-Sephacel (Sigma), le milieu de culture récolté est ajusté à pH 8 et chargé à 0,25 mL/min. Le chromatogramme présenté, obtenu sur un Akta basic (Amersham), montre la phase de rinçage de la colonne (50 mL) puis l’élution de l’endocan par l’ajout d’une solution à 1M NaCl. Le tracé bleu permet de suivre l’absorbance à 280 nm, le tracé rouge la conductivité et le tracé vert le pourcentage théorique du tampon B contenant 1M NaCl. Durant la phase de rinçage beaucoup de protéines ne sont pas retenues sur la colonne. Le gradient à 1 M NaCl permet d’éluer les protéines (dont l’ endocan) qui étaient retenues sur la colonne.

Rinçage : 50 mL Tris 50mM NaCl 0,2M 10 mL Tris 50mM NaCl 1M

échantillon. Selon les modes de production utilisés, la taille des colonnes a dû être adaptée pour que le chargement soit effectué en moins de 24 heures. Par exemple, pour la purification de dix récoltes, le volume à traiter pour les surnageants issus des CL1000 (180 mL) est différent du volume à traiter pour une culture en flask ou en spinner (8 Litres). Dans le premier cas, une colonne C10/10 (Amersham) avec 5 mL de résine suffit à avoir un débit de 0,25 mL/min, dans le second une colonne XK50/50 (avec 30 mL de résine) permettant un débit de 5 mL/min est plus adapté. Les volumes d’élution à traiter sont bien entendu à prendre en considération dans les étapes suivantes. Après abaissement de la salinité par dialyse, la seconde étape de purification est réalisée par immunoaffinité. Les colonnes utilisées pour l’ensemble des purifications ont été des HiTrapNHS (Amersham). La Figure 3B montre le profil du chromatogramme obtenu lors de l’élution d’endocan sur une colonne "HiTrapNHS- EP204" par une solution de MgCl2 4M. D’autres tampons plus couramment utilisés en

laboratoire pour effectuer l’élution d’une colonne d’immunoaffinité ont été testés comme, par exemple, une solution de glycine 10 mM pH 2, mais aucune d’entres elles n’ont donné de résultats positifs. Afin de supprimer la solution "visqueuse" de MgCl2, la mise en place d’un

protocole de déssalage utilisant une colonne HiPrep 26/10 Desalting a donné des résultats plus intéressants que l’utilisation de la dialyse qui avait du mal à faire disparaître toutes les traces de MgCl2 (élément très important pour l’utilisation de l’endocan in vivo puisque le Mg peut

être toxique).

Dans un souci de dosage et du contrôle de la qualité des protéines recombinantes ainsi produites, plusieurs mesures ont été définies. Tout d’abord, concernant la quantification d’endocan, le test ELISA originellement développé par Philippe Lassalle et repris par nos laboratoires (Endotis Pharma et IBS), fonctionne très bien à condition de posséder un endocan étalon. Une autre méthode de dosage a pu être utilisée après purification d’endocan. C’est le dosage BCA (Pierce ou Sigma), avec toujours de l’endocan recombinant comme étalon et non de la BSA. Afin de définir la pureté et la concentration exacte d’un échantillon d’endocan purifié (pour définir un étalon par exemple), le meilleur moyen a été l’analyse protéique (analyse du ratio de chaque acide aminé dans un échantillon). Il a été remarqué que dans le cas d’endocan, le coefficient d’extinction molaire d’endocan variait énormément en fonction du tampon pour un même lot d’endocan. La chaîne de DS semble avoir une influence dans la détermination du coefficient d’extinction molaire. Ce moyen de dosage de la quantité d’endocan n’a donc pas été conservé. Concernant l’intégrité de l’endocan, un Western Blot a été réalisé sur chaque lot d’endocan purifié, avec l’anticorps EP221 capable de détecter

Gel en Bleu de coomassie

WB

Figure 3B: La deuxième étape de la purification d’endocan est une chromatographie d’immunoaffinité

Sur une colonne HiTrapNHS (amersham) sur laquelle l’anticorps monoclonal EP204 a préalablement été immobilisé, l’endocan récupéré par élution de la chromatographie d’échange d’ions est chargé en boucle (5 passages à 0,1 mL/min). Le chromatogramme présenté, obtenu sur un Akta basic (Amersham), montre la phase d’élution de la colonne avec une solution de 4 M MgCl₂. Le tracé bleu permet de suivre l’absorbance à 280 nm, et le tracé rouge la conductivité. L’ajout de MgCl_2, qui fait augmenter la conductivité, permet d’éluer l’endocan (tracé bleu). Un gel SDS-PAGE ainsi qu’un WB sont réalisés sur chacune des fractions de l’élution, cela permet de vérifier la présence d’endocan (WB) et permet d’avoir une idée sur la présence de potentielles protéines contaminantes (coloration au bleu de coomassie).

Grâce à l’intégration de ces différentes optimisations des systèmes de production cellulaire (augmentation de la biomase et diminution des volumes), il a ainsi été possible de produire par semaine environ 7 à 8 mg d’endocan par CL1000. La purification de cette protéine recombinante dure ensuite globalement deux jours et le contrôle de l’intégrité et de la pureté (contrôle de la qualité) dure une autre journée. Les méthodes ainsi développées permettent d’obtenir avec un rendement de 50 %, environ 3 à 4 mg de protéoglycanne avec un très bon degrès de pureté, ce qui est très satisfaisant pour un système d’expression eucaryote.

1.2. PRODUCTION ET PURIFICATION DU CORE PROTEIQUE D’ENDOCAN