PURIFICATION DE LA CHAINE DS D’ENDOCAN

Purification de la chaîne de dermatane sulfate d’endocan Par digestion enzymatique du core protéique

200 µL d’endocan (200 µg/mL) sont mis en présence de 22 µL de papain 10X (10 mg/mL de papain dans un tampon acétate de sodium 1 M, EDTA 50 mM et Cystéine 50 mM pH 7) pendant 24 heures à 65°C. 24 µL de papain 10X sont rajoutés, la réaction est incubée pendant 5 autres heures. Les protéines sont précipitées au TCA. Pour cela, 25 µL de TCA 100 % sont ajoutés pendant 30 minutes, à 4°C, sous agitation. Après centrifugation, le surnageant est conservé (chaîne DS). Le culot est rincé avec 50 µL de TCA 10 %, pendant 30 minutes, à 4°C, sous agitation. Après centrifugation, le surnageant est conservé et ajouté avec le premier surnageant pour être dialysé contre un tampon phosphate 20 mM pH 6. Les chaînes DS sont ensuite purifiées en utilisant 500 µL de résine DEAE-Sephacel (Sigma) dans un biospin (Biorad). Pour cela, les chaînes oligosaccharidiques sont déposées sur la résine préalablement

tampon Tris 50 mM, NaCl 0,15 M, puis les chaînes sont éluées avec une solution de Tris 50 mM, NaCl 1 M pour être ensuite dialysées contre de l’eau, puis finalement lyophilisées.

Par coupure chimique (β-élimination) de la liaison entre le core protéique et la chaîne DS Un volume d’échantillon et un volume d’une solution de NaOH 100 mM, NaBH4 2 M

ainsi qu’1 µL de rouge de phénol (colorant indicateur de pH) et de l’acide acétique glacial (jusqu’à ce que le rouge de phénol vire au jaune) sont co-incubés dans un tube « haut » (en raison de la production de gaz), pendant 24 heures, à 37°C. La réaction est stoppée en ajoutant du NaOH concentré jusqu’à ce que le rouge de phénol vire au pourpre (pH 7). Les chaînes de DS sont alors purifiées de la même façon qu’au paragraphe précédent, en utilisant une résine DEAE-Sephacel.

Gel d’acrylamide pour oligosaccharides (PAGE)

Afin de visualiser les chaînes de DS d’endocan, après purification nous avons réalisé des électrophorèses en gels d’acrylamide pour oligosaccharides. Ils se composent d’un gel de concentration de 4 % (3,8 mL d’H20 ; 625 µL Tris 1M pH 6,8 ; 830 µL acrylamide (49 :1) 50 % (Sigma) ; 5 µL TEMED ; 50 µL persulfate d’ammonium 10 %) et d’un gel de séparation de 30 % (1,8 mL H2O, 3 mL Tris 1,5 M pH 8,8, 7,2 mL acrylamide (19 :1) 50 % (Sigma), 15 µL

TEMED, 18 µL persulfate d’ammonium 10 %). Les échantillons sont déposés avec 20 % de glycérol. Un marqueur de migration contenant du bromophénol, du xylène cyanol et du rouge de phénol dans du glycérol 20 % peut être utilisé. Le tampon de migration (20 mA) utilisé est composé de Tris 25 mM / Glycine 200 mM. Le gel est ensuite coloré avec du bleu Azure A (0,08 % dans H2O) pendant 10 à 15 minutes, puis rincé à l’eau.

Quantification des chaînes de DS par dosage colorimétrique des acides uroniques (dosage carbazole selon la méthode de Bitter et Muir, 1962)

La quantité de DS est estimée par référence à une gamme de concentration de DS de source commerciale (50, 25, 12,5, 6,25, 0 µg/mL). 150 µL de tétraborate de sodium (0,025 M dans H2SO4) sont placés dans un tube en verre refroidi à 4°C. Lentement, 30 µL d’échantillon

(à doser ou de la gamme) sont déposés sur la surface. Les tubes sont fermés avec un bouchon en téflon, agités puis incubés pendant 10 minutes, à 100°C. Après refroidissement à température ambiante, 6 µL de carbazole (0,125 % dans de l’éthanol) sont ajoutés. Les tubes sont alors à nouveau agités, puis incubés 15 minutes, à 100°C. Après refroidissement à température ambiante, l’absorbance est mesurée à 530 nm. Pour la gamme de concentration,

courbe étalon. La concentration en acide uronique d’un échantillon est obtenue en se rapportant à la courbe étalon.

1.3.2. Résultats et discussion

L’intérêt de savoir purifier la chaîne DS d’endocan était multiple. Pour la caractérisation de la chaîne, cela allait être bien évidemment nécessaire, autant à l’échelle du microgramme pour la caractérisation de la chaîne radiomarquée qu’à l’échelle du milligramme pour l’étude par RMN. La purification par β-élimination était adaptée à ce type d’étude car il était important de dissocier complètement la chaîne DS du core protéique afin de ne laisser aucune trace "protéique" pouvant interférer lors de l’analyse RMN. Pour évaluer la nature des interactions entre différents médiateurs et endocan, il était également très intéressant de posséder suffisamment de DS purifié afin d’être en mesure de dissocier la nature d’éventuelles interactions (entre le core protéique ou la chaîne DS). Pour l’étude des interactions avec le DS d’endocan, il était utile de posséder à l’extrémité de la chaîne, une amine qui allait pouvoir permettre l’immobilisation du DS sur une surface Biacore. Dans ce cas, la purification du DS par la papaïne était la méthode la plus favorable. Pour les médiateurs amenés à interagir avec le DS d’endocan, une banque oligosaccharidique serait en fait nécessaire afin de caractériser la structure (taille, sulfatation) du DS impliqué dans l’interaction. Finalement, toujours dans l’objectif d’analyser de façon dissociée les fonctions à la fois du core protéique et de la chaîne d’endocan, dans des essais visant à mettre en évidence les fonctions d’endocan, il était intéressant de posséder le DS d’endocan.

1.4. CONCLUSION

Pour la mise en place de plateformes de purification d’endocan, de son core protéique et de sa chaîne de DS nous avons suivi des protocoles classiquement utilisés pour les PGs et pour endocan en particulier (Iozzo : proteoglycan protocols, 2001 ; Béchard et al., 2001). Cependant, concernant la production, l’adaptation des cellules HEK293 à la culture en bioréacteur CL1000 a été une optimisation remarquable. Ce genre de bioréacteur, encore peu utilisé, avait été initialement développé pour la production d’anticorps pour remplacer notamment la production en ascites. A notre connaissance, aucune donnée bibliographique n’a encore été référencée concernant ce procédé de production pour les cellules eucaryotes

bénéfique pour augmenter le rendement de production de l’endocan recombinant, pour diminuer les volumes à traiter en purification et, consécutivement, pour maintenir l’intégrité de ce PG fortement sensible à la dégradation.

Pour résumer, la plateforme technologique mise en place a donc permis d’obtenir des molécules recombinantes à l’échelle du milligramme par semaine, à partir d’un système d’expression eucaryote, avec un très bon degré de pureté, que ce soit pour l’endocan, son core protéique ou sa chaîne de DS.

2. CARACTERISATION STRUCTURALE ET