PRODUCTION ET PURIFICATION DU CORE PROTEIQUE D’ENDOCAN

Production du core protéique d’endocan

La production du mutant d’endocan (S137A) ne possédant pas la chaîne DS est réalisée en bioréacteur CL1000 dans les mêmes conditions que celles décrites pour l’endocan sauvage à l’exception que l’ensemencement optimal doit se faire avec 160 millions de cellules / CL1000.

Purification du core protéique d’endocan

Le pH du milieu de culture récolté est ajusté à pH 9 avant l’application sur une colonne de Q-Sepharose (Amersham) (5 mL de résine dans une colonne C10/10). La colonne est lavée avec 6 volumes de tampon 50 mM Tris, pH 9. L’endocan ainsi fixé est élué par un gradient de 0 à 1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 9. Les fractions contenant le core protéique d’endocan (visualisation par SDS-PAGE ou WB) sont rassemblées. Le core protéique est alors appliqué sur une colonne d’affinité de type HiTrapNHS (Amersham) sur laquelle l’anticorps monoclonal EP236 avait préalablement été immobilisé à raison de 8 mg par mL de résine. La colonne d’immunoaffinité est rincée avec un tampon Tris 50 mM NaCl 0,2 M, pH 8 puis l’endocan est élué avec une solution de glycine 10 mM pH 2. Des fractions de 900 µL sont récupérées, et instantanément neutralisées par 100 µL de Tris 250 mM. Les fractions contenant le core protéique d’endocan sont rassemblées. Le changement de tampon et la concentration des échantillons se font par filtration à travers une membrane de porosité inférieure à 10 000 Da (Amicon Ultra Centrigugal Filter Devices 10000 MWCO de Millipore).

Figure 4A: Première étape de la purification du core protéique d’endocan par chromatographie d’échange d’anions

Sur une colonne C10/10 (5 mL de résine Q-Sepharose) (Amersham), le milieu de culture récolté est ajusté à pH9 et chargé à 0,25 mL/min.

a - Le chromatogramme présenté, obtenu sur un Akta basic (Amersham) montre l’élution de l’endocan par un gradient de 0 à 1 M de NaCl. Le tracé bleu permet de suivre l’absorbance à 280 nm, le tracé rouge la conductivité et le tracé vert le gradient théorique de NaCl. Le gradient permet d’éluer les protéines (dont le core protéique d’endocan) selon trois ‘’pics’’ principaux.

b - Le suivi des chromatographies par Dot-Blot permet de dire que la partie protéique d’endocan est éluée dans le premier pic. Sur le Dot Blot sont déposés : le milieu de culture chargé sur la colonne (R3 = récolte 3, R4 = récolte 4, R3+4 = mélange des deux récoltes qui a été chargé sur la colonne), les protéines non retenues sur la colonne = OUT, les protéines décrochées pendant le rinçage = Rinç, un échantillon de chacune des fractions = fractions 1 à 20. 1 M NaCl 0 M NaCl 7 9 11 13 15 a b

1.2.2. Résultats et discussion

A l’image de l’endocan sauvage, la production et la purification du core protéique d’endocan ont été également mises en place pour mener à bien plusieurs projets. Dans le cadre des travaux de thèse, la partie protéique d’endocan ainsi obtenue devait pouvoir être utilisée pour étudier les interactions avec d’autres molécules, pour développer des essais visant à caractériser les fonctions d’endocan et également pour permettre d’entreprendre des travaux de cristallisation. Dans le cadre des projets d’Endotis Pharma, le core protéique d’endocan devait également être utilisé pour des essais in vivo chez la souris. Comme pour l’endocan, l’objectif était de mettre en place un système de production et purification permettant l’obtention de plusieurs milligrammes de protéines.

Le système d’expression utilisé reste le même que pour la production d’endocan sauvage, à la différence que sur l’ADNc d’endocan dans le vecteur d’expression, une mutation sur le codon de la sérine 137 a été introduite. La sérine 137 est alors remplacée par une alanine, ce qui ne permet plus l’ancrage de la chaîne de DS sur l’endocan (Béchard et al., 2001). La lignée stable d’HEK293 transfectée avec le vecteur pcDNA3 contenant l’ADNc muté conçue par l’équipe de Philippe Lassalle (Institut Pasteur de Lille) a également été transférée au sein d’Endotis Pharma. La lignée exprimant le core protéique d’endocan permet, de la même façon que pour endocan, l’expression dans le milieu de culture. Les cellules sont pourtant moins adhérentes que les cellules HEK293 exprimant endocan. Bien qu’une production en flask soit possible, la culture en spinner n’a, en revanche, pas pu être adaptée. Pour des raisons évidentes d’efficacité, la production du core protéique d’endocan a été réalisée en CL1000. Les conditions optimales d’utilisation ont été définies et nécessitent un ensemencement de 160 millions de cellules par CL1000 avec un passage tous les trois jours et demi au cours duquel la viabilité est estimée à environ 50 %.

Concernant la purification du core protéique, plusieurs méthodes de chromatographie d’échange d’ions ont été tentées. En effet, des colonnes telles que la DEAE-sephacel et la SP- sepharose ont par exemple été testées avec différents tampons et à différents pH. Nos résultats ont montré que la Q-sépharose était la colonne qui donnait les meilleurs résultats à pH 9. La Figure 4A montre que le core protéique d’endocan sur une telle colonne est élué de 0 M NaCl à 0,5 M NaCl. Comme cela a été établi pour la purification d’endocan, la seconde étape de purification est une chromatographie d’immunoaffinité. Le core protéique d’endocan ne réagit pas de la même façon que l’endocan vis-à-vis des anticorps monoclonaux développés. Ainsi,

Figure 4B: La deuxième étape de la purification du core protéique d’endocan est une chromatographie d’immunoaffinité

Sur une colonne HiTrapNHS (amersham) sur laquelle l’anticorps monoclonal EP236 a préalablement été immobilisé, l’endocan récupéré lors de la chromatographie d’échange d’ions est chargé en boucle (5 passages à 0,1 mL/min). Le chromatogramme présenté, obtenu sur un Akta basic (Amersham), montre la phase de fin de chargement (20 mL OUT), la phase de rinçage (40 mL Rinçage) et la phase d’élution du core protéique d’endocan avec une solution de glycine 10 mM pH2. Le tracé bleu permet de suivre l’absorbance à 280 nm, le tracé rouge la conductivité.

Conductivité

DO 280nm

purification via l’anticorps EP236 ont été étudiées, et plus particulièrement les conditions nécessaires à l’élution. Par comparaison avec l’endocan, le fait de ne pas devoir effectuer une élution avec une forte concentration de MgCl2 est réellement intéressant (volume d’élution,

déssalage). Le chromatogramme d’immunoaffinité correspondant à l’utilisation de l’anticorps EP236 est présenté Figure 4B.

En appliquant le protocole mis en place, il est possible d’obtenir pour la production d’une CL1000 pendant une semaine, et après 1 jour et demi de purification environ 5 mg de core protéique d’endocan. Contrairement à ce qui avait été observé pour l’endocan, la concentration du core protéique d’endocan purifié peut être estimée grâce à la lecture d’absorbance à 280 nm. Le coefficient d’extinction molaire mesuré est de 1,06 mg-1.mL.cm.

La production du core protéique d’endocan en utilisant un système bactérien avait été mise en place chez E.coli de type Origami (facilitant la formation des ponts disulfures). Les 11 cystéines des 110 premiers acides aminés suggèrent que plusieurs ponts disulfures prennent place pour structurer la protéine. Comme aucun test d’activité spécifique d’endocan n’est pour l’instant disponible, la renaturation correcte de la protéine apparaît difficile à appréhender et donc ce mode de production n’a pas été retenu pour l’instant.

1.3. PURIFICATION DE LA CHAINE DS D’ENDOCAN