Nous venons de mentionner que le stress hypertonique ou l’expression de WNK3 exerçaient des effets différents sur les variants de NKCC2. Notamment, soulignons que seul NKCC2A était affecté dans ses caractéristiques cinétiques par le stress hypertonique et que seul NKCC2F était très peu affecté dans son expression par ce même stress et par WNK3. Ces données suggèrent fortement que la partie variable des NKCC2 joue un rôle de régulation important.
Selon les prédictions basées sur l’indice d’hydrophobicité des acides aminés, le domaine CS2 se retrouve dans le cytosol, ce qui lui permettrait d’interagir avec des intermédiaires signalétiques. Je n’ai pas étudié le rôle du TM2 dans la régulation de NKCC2, car cet autre domaine se retrouve probablement enfoui dans la bicouche et parce qu’il semble déjà jouer un rôle important dans le transport ionique intrinsèque (109, 128, 176). Comme les données présentées jusqu’à maintenant suggèrent que le domaine CS2 pourrait contenir des résidus impliqués dans le trafic, la stabilisation ou la phosphorylation du transporteur, j’ai tenté de les identifier par des études de mutagénèse dirigée.
4.3.1. Résidus phosphoaccepteurs potentiels
J’ai d’abord suspecté la présence de résidus phosphoaccepteurs dans le domaine CS2. En effet, la régulation différentielle des variants par la cascade WNK-SPAK/OSR1 ou l’hypertonicité aurait pu être soutenue par un résidu S ou T conservé, mais dont l’accessibilité varie selon la nature des résidus avoisinants. Il y a trois tels résidus dans le domaine CS2, soit S229, S231 et T235. J’ai les ai donc mutés par des résidus A pour rendre le site phosphoaccepteur potentiel inactif et par E ou D pour imiter l’état phosphorylé. Ces études, qui ne sont pas présentées dans cette thèse, ne se sont pas révélées concluantes. De fait, les mutations E et D abaissaient l’activité de transport alors que l’on aurait attendu une augmentation.
4.3.2. Résidu 234
Le rôle des résidus divergents en position 234 a aussi été étudié, mais l’analyse des mutants s’est révélée difficile d’interprétation. Par exemple, la capacité de transport des mutants
NKCC2AA234C et NKCC2BA234C n’était pas différente de celle du type sauvage alors que celle du mutant NKCC2FC234A diminuait de façon importante. J’ai conclu que les mutations altéraient sans doute la conformation du domaine CS2 de manière non spécifique.
4.3.3. Résidu 230
Gimenez et Forbush (128) avaient étudié l’effet de plusieurs permutations entre les variants de NKCC2 dans le but d’identifier les résidus qui caractérisaient l’affinité propre de chaque variant. Dans la CS2, ils ont identifié que les résidus en position 230, 234 et 238, dans cet ordre décroissant, avaient le plus d’effet sur l’affinité ionique.
Comme eux, j’ai trouvé que le résidu en position 230 était impliqué dans la détermination de l’affinité ionique. De manière intéressante, j’ai montré que ce résidu joue un rôle supplémentaire dans l’expression à la membrane. En effet, bien que l’activité de transport du mutant NKCC2BT230M était nulle, son expression à la surface cellulaire augmentait. Le mutant NKCC2FM230T adoptait un comportement inverse : son activité de transport était augmentée en concomitance avec une diminution de son expression membranaire. En somme, le résidu en position 230 influence à la fois l’affinité pour les ions et le trafic du transporteur.
4.3.4. Résidu 238
Comme tout juste mentionné, Gimenez et Forbush (128) avaient montré que le résidu en position 238 jouait un rôle dans l’affinité ionique de NKCC2. Toutefois, ils n’avaient pas fourni de données quant au rôle de ce résidu sur la capacité de transport ou l’expression du transporteur à la membrane.
Mes premières investigations ont montré que le résidu V238 retrouvé chez NKCC2F augmentait de façon importante la capacité de transport lorsqu’il était inséré chez les autres variants. Chez NKCC2F, lorsque ce résidu n’était pas une V, la capacité de transport était au contraire très basse. Par la suite, j’ai aussi montré que dans NKCC2B, cette substitution pour une V (NKCC2BY238V) ne modifiait pas l’affinité du transporteur, mais qu’elle augmentait l’expression à la surface cellulaire en diminuant la vitesse d’endocytose sans affecter le recyclage.
Pour la première fois, j’ai donc mis en évidence que certains résidus du domaine CS2 étaient impliqués dans le trafic du transporteur. Ce domaine de NKCC2 pourrait ainsi permettre une régulation de l’endocytose du transporteur, et ce, d’une manière qui varie en fonction de la séquence de résidus présente.
4.3.5. Implications des voies dépendantes et indépendantes des clathrines dans l’endocytose de NKCC2
On savait déjà que l’endocytose de NKCC2 était contrôlée par les voies dépendantes et indépendantes des clathrines (22). J’ai donc tenté de caractériser ces voies pour l’endocytose du mutant NKCC2BY238V. À cette fin, j’ai utilisé la chlorpromazine, qui inhibe l’endocytose médiée par les clathrines, et la filipin III, qui séquestre le cholestérol inhibant ainsi les voies indépendantes des clathrines.
Plusieurs conditions expérimentales ont été testées, mais l’effet de ces agents s’est révélé difficile d’interprétation. En outre, la chlorpromazine n’a que faiblement augmenté la capacité de transport de NKCC2 et du mutant NKCC2BY238V qui était similaire. Quant à la filipin III, elle s’est avérée toxique pour les ovocytes à des doses relativement standards.
Le résidu Y238, retrouvé uniquement chez NKCC2B, pourrait faire partie d’un motif d’internalisation reconnu par AP-2. Toutefois, ce motif ne serait pas classique puisqu’il n’est pas de type YXXΦ, [D/E]XXX[L/I] ou FXNPXY (291). Par ailleurs, il ne s’apparente à aucun autre type de signal.
En somme, bien que je n’aie pu identifier les voies de l’endocytose impliquées dans la reconnaissance de la partie variable de NKCC2, je peux néanmoins conclure que les résidus en position 230 et 238 jouent un rôle dans ce processus. La force du motif englobant les positions 230 et 238 dépendrait ainsi des résidus présents : elle serait plus faible chez NKCC2F (M230 et V238) et plus forte chez NKCC2B (T230 et Y238).
4.4. Identification de résidus divergents conférant une différence dans la réponse à