Phosphorylation totale du transporteur

Une seconde limitation de nos recherches concerne l’état de phosphorylation globale du transporteur lors des conditions testées. Il aurait été intéressant de pouvoir quantifier cette phosphorylation pour chacune des conditions en utilisant une méthode déjà éprouvée dans notre laboratoire pour KCC4 et NKCC1 (31, 106). Il m’a toutefois été impossible d’obtenir

une quantité suffisante de NKCC2 immunoprécipité pour procéder à ces expériences malgré l’utilisation de nombreuses constructions avec différentes étiquettes et de nombreuses conditions expérimentales. Une alternative aurait été d’exploiter des phosphoanticorps commerciaux, mais elle n’aurait pas mené à des résultats nouveaux puisque l’effet de la cascade WNK-SPAK/OSR1 sur la phosphorylation des résidus ciblés par ces anticorps était déjà connu.

Conclusion

L’hypothèse de mes recherches était que les variants NKCC2 sont activés de manière différente par la cascade WNK-SPAK/OSR1 lors du rétrécissement cellulaire. Les résidus divergents contenus dans la portion cytosolique codée par les exons alternatifs 4A, 4B et 4F engendrent les réponses différentes et pourraient faire partie d’un domaine de régulation unique à chaque variant. Mes travaux de doctorat ont permis d’identifier un nouveau mécanisme par lequel le stress hypertonique stimulait l’activité de transport de NKCC2, soit en augmentant le trafic à la surface cellulaire. Cette activation dépendait en partie de celle de la voie des kinases WNK, mais variait en fonction de l’isoforme en jeu. En effet, WNK3, mais pas WNK1, augmentait l’expression membranaire en accélérant le recyclage endocytique. De plus, la réponse de NKCC2F au stress hypertonique et aux kinases WNK était moins prononcée que les deux autres variants, ce qui me laisse croire que ce variant est régulé moins strictement dans l’AAH. Ces résultats ont suggéré que la partie variable de NKCC2 était impliquée dans la régulation du cotransporteur.

J’ai aussi fait la démonstration que le domaine CS2 jouait un double rôle, soit de coordonner la liaison des ions et le trafic du transporteur. En particulier, j’ai montré que les résidus 230 et 238 sont tous deux impliqués dans l’expression membranaire du transporteur et il avait été montré auparavant qu’ils jouent un rôle dans la détermination de l’affinité ionique. Au meilleur de notre connaissance, c’était la première fois qu’un tel rôle était attribué au même domaine dans un système de transport et qu’un domaine d’internalisation était identifié chez un CCC. Ces découvertes offrent des perspectives intéressantes pour mieux comprendre les mécanismes de mouvement des ions par les cotransporteurs.

Perspectives de recherche

Les études présentées dans cette thèse ont offert plusieurs réponses aux objectifs énoncés, mais des questions sont demeurées en suspens et d’autres interrogations ont émergé en cours de route. Nous allons explorer quelques-unes de ces questions ou interrogations qui mériteraient des investigations supplémentaires éventuellement.

En premier lieu, nous avons identifié des résidus, ceux en position 230 et 238 de NKCC2, qui semblaient faire partie d’un signal d’internalisation puisqu’ils influençaient l’expression du transporteur à la surface cellulaire. Toutefois, nous avons constaté que ces résidus ne pouvaient expliquer à eux seuls l’effet singulier du stress hypertonique et de WNK3 sur NKCC2F. Il serait alors d’intérêt d’étudier les effets de ces stimuli sur les mutants NKCC2 dont les résidus en position 230 et 234 sont intervertis.

En deuxième lieu, nous n’avons pas tenté de caractériser les voies signalétiques impliquées dans l’augmentation du taux de recyclage à la membrane de NKCC2 par WNK3. De fait, une multitude de protéines adaptatrices pourraient l’être, et parmi celles-ci, certaines sont plus intéressantes que d’autres puisqu’elles ont été impliquées dans le trafic d’autres transporteurs en partenariat avec des kinases WNK ou dans le trafic de NKCC2 en soit. Ces protéines incluent VAMP2/3, SCAMP2 et AP-1 (43, 66, 441, 445). L’implication des GTPases Rab dans les vésicules intracellulaires associées au recyclage pourraient aussi être en cause (19). Nous n’avons pas non plus identifié les partenaires signalétiques impliqués dans la diminution de l’endocytose du mutant NKCC2BY238V_{. D’autres agents inhibiteurs et d’autres} méthodes menant à l’inhibition des différentes voies de l’endocytose auraient pu être employés. Dans le but d’inhiber la voie des clathrines, par exemple, le peptide synthétique PP19, qui bloque la formation du complexe entre la clathrine, l’endophiline et la synaptojanine, et l’inhibiteur chimique PitStop2 auraient pu être utilisés.

Pour les voies indépendantes des clathrines comme les radeaux lipidiques, des siRNA ciblant la cavéoline, principale protéine présente dans les radeaux lipidiques, serait une méthode intéressante (22). L’injection de siRNA dans les ovocytes est toutefois peu courante et difficile à réaliser bien que possible (103). Pour investiguer la participation de la dynamine,

une GTPase impliquée dans plusieurs voies de l’endocytose, il existe aussi l’inhibiteur chimique Dynasore ou encore un mutant de la dynamine ayant un effet dominant négatif (Dyn-2 K44A) (22).

En troisième lieu, l’étude de l’exocytose selon le protocole développé par Caceres et al. (42), un protocole qui pourrait être adaptable aux ovocytes, permettrait de mieux caractériser le trafic de NKCC2. Logiquement, la quantité de transporteurs présents à la surface cellulaire est déterminée par l’exocytose de NKCC2 contenus dans les vésicules à proximité, l’endocytose des transporteurs déjà à la surface, et le recyclage de ceux-ci à la membrane après avoir été endocytés. Une augmentation de l’exocytose pourrait expliquer une partie de l’effet du stress hypertonique sur le trafic de NKCC2.

En quatrième lieu, les réponses distinctes produites par WNK1 et WNK3 pourraient signifier que ces deux isoformes sont régulés par des voies différentes, ou bien alors qu’ils interagissent d’une façon singulière avec SPAK/OSR1. Une hypothèse émise précédemment est que d’autres voies pourraient être impliquées dans la réponse au stress hypertonique et qu’entre autres, ces voies feraient intervenir la contribution des kinases ERK1/2 et MAP p38 qui ont été identifiées dans différentes réponses cellulaires aux stress hypotonique et hypertonique, respectivement (155, 277). De surcroît, des études ont aussi montré que MAP p38 avait la capacité de phosphoryler WNK4 (238).

À plus long terme, mes travaux pourraient contribuer au développement d’agents inhibant un variant NKCC2 à la fois. J’ai montré que l’hypertonicité et WNK3 affectent peu l’expression membranaire de NKCC2F, ce qui nous indique que ce variant est plus stable à la surface cellulaire. On pourrait alors agir sur les mécanismes du trafic cellulaire, sur les voies d’endocytose ou de recyclage, ou bien encore directement sur la partie variable pour réguler l’expression membranaire des variants et ainsi moduler leur activité. Quelques figures de cas illustrent les bénéfices possibles advenant le développement de ces inhibiteurs.

Les patients atteints de nécrose tubulaire aigüe souffrent d’une réabsorption tubulaire déficiente. Sous cette condition, un important volume de filtrat inonde la macula densa et le variant NKCC2B, par son rôle dans le RTG, informe le glomérule de diminuer, voire d’arrêter la filtration. Pour ces patients, l’inhibition spécifique de NKCC2B permettrait de

préserver une diurèse. Il serait d’intérêt de pouvoir bloquer NKCC2A chez les patients atteints du syndrome de sécrétion inappropriée de l’ADH. Ce syndrome engendre une augmentation de la réabsorption d’eau et une hyponatrémie en conséquence. En bloquant NKCC2A, la concentration de la médullaire diminuerait, créant ainsi un environnement défavorable à la réabsorption d’eau en trop grande quantité. Pour terminer, il existe des inhibiteurs du transporteur sodium-glucose SGLT2 utilisés dans le traitement du diabète. Une diminution de la pression intraglomérulaire a été observée chez certains de ces patients (63). L’hypothèse avancée pour expliquer cet effet est que NKCC2B détecte l’augmentation du filtrat et envoie un signal au glomérule de diminuer le débit de filtration. Cet effet protecteur pourrait être récréé chez des patients non diabétiques en bloquant NKCC2F. En effet, on obtiendrait une augmentation du filtrat causée par une perte de sels, engendrant le même mécanisme de RTG par NKCC2B.

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