Réparation des CDBs

Pour réparer les CDBs, la cellule dispose de différents mécanismes (Figure 5). Quand la chromatide sœur est présente, la cellule va préférentiellement l’utiliser comme matrice afin de réparer le brin endommagé, c’est le mécanisme de recombinaison homologue (RH). Un autre mécanisme appelé jonction d’extrémité non homologue (NHEJ), existe et va permettre la ligation « directe » des brins d’ADN. Un troisième type de réparation est présent, la voie du «Single- Strand Annealing » (SSA) qui s’utilise entre deux séquences répétées directes aux extrémités de la cassure, c’est une voie transitionnelle entre la NHEJ et la RH.

a. La recombinaison homologue

La RH est un processus basé sur un échange d’information génétique grâce à un événement de recombinaison entre deux séquences d’ADN dont l’une est porteuse de dommages, et nécessitant une longue séquence d’homologie (Figure 6). Pour cela, une fois la cassure détectée, l’activité exonucléase 5’-3’ du complexe MRN va engendrer une longue extrémité simple brin 3’ sortant de plus de 100 paires de bases. Cette extrémité va servir de substrat pour recruter la machinerie de réparation. Dans un premier temps, la protéine RPA se fixe sur l’ADN simple brin afin de le protéger de la dégradation et de faciliter la formation du filament Rad51 en position 3’. Rad51, aidé de Rad52 et de Rad54, va initier la recherche de séquence d’homologie au niveau de la chromatide sœur qui va servir de matrice. Une fois la séquence trouvée, une jonction d’HOLLYDAY va être formée. Une des extrémités libre va envahir l’hélice d’ADN intacte et permettre ainsi l’échange de brins. Puis l’extrémité libre 3’ va s’hybrider au niveau de la matrice et une ADN polymérase va permettre la synthèse du brin. Une fois la polymérisation du nouveau brin finie, la jonction de HOLLIDAY se referme et le brin nouvellement synthétisé est ligaturé par l’ADN ligase I (Hoeijmakers 2001; Valerie and Povirk 2003). BRCA1 et BRCA2, activées par ATM, jouent aussi un rôle dans la RH. En effet, ils interagissent avec Rad51 et

semblent stimuler la RH car BRAC2 aide au recrutement de Rad51 sur l’ADN et BRCA1 pourrait servir de coordinateur à la RH (Valerie and Povirk 2003). La RH est un processus très conservatif, il est qualifié d’ « error-free », car il permet la restauration de la séquence sans perte d’information génétique.

b. Le Single-Strand Annealing

Le SSA est un processus non conservatif, car son utilisation entraine des délétions, des insertions et des translocations. Ce mécanisme de réparation est basé sur l’hybridation de deux séquences répétées directes aux extrémités 3’ de la cassure et de la délétion des nucléotides entre l’extrémité 3’ et la séquence répétée (Figure 7). Le SSA peut être considéré comme une variante de la RH, car l’initiation du processus est identique aux deux voies. En effet, après détection de la cassure, une endonucléase, comme le complexe MRN, va générer une extrémité simple brin 3’ sortant qui sera protégée par RPA. Ces extrémités sont générées jusqu’à l’exposition de séquences répétées directes qui sont capables de s’apparier par complémentarité de bases. Le complexe XRCC1/XPF (une nucléase impliquée dans le NER) va permettre l’incision du brin non homologue, puis une ADN polymérase va synthétiser les nucléotides manquants et les brins vont pouvoir être religués (Valerie and Povirk 2003). Contrairement à la RH, Rad51 n’est pas requis de même que l’utilisation d’un brin complémentaire servant de matrice. Par contre la protéine Rad 52 semble jouer un rôle important dans la liaison initiale aux extrémités de la cassure et potentialise la recherche des séquences homologues entre les extrémités (Van Dyck et al. 2001). Le SSA semble être une voie peu utilisée chez les cellules eucaryotes et pourrait réparer le génome au niveau des séquences répétitives.

c. La réparation par jonction d’extrémité non homologue

La voie de la NHEJ utilise plusieurs enzymes qui reconnaissent les extrémités de l’ADN et les maintiennent proches grâce à un complexe synaptique afin de permettre la religature des deux brins. A la différence de la RH, la NHEJ n’a pas besoin d’homologie pour effectuer la ligation des deux extrémités, ce qui lui permet d’être présente tout au long du cycle cellulaire et fait d’elle la voie majoritaire de la réponse aux CDBs.

a. Le mécanisme de la NHEJ

Le processus de la NHEJ (Figure 8) est initié par la fixation de l’hétérodimère Ku, composé de deux sous unités Ku70 et Ku80, aux extrémités libres de l’ADN. Une fois fixé, Ku va recruter la sous unité catalytique du complexe, la protéine DNA-PKcs pour former le complexe DNA-PK (pour Protéine Kinase dépendante de l’ADN) (Uematsu et al. 2007). Lorsque la DNA-

Figure 7 : Schéma représentatif du Single-Strand Annealing d’après (Valerie and Povrick. 2003)

Reconnaissance de la CDB et génération de l’extrémité 3’ simple brin

Recrutement de Rad52

Séquence répétée trouvée

Incision du brin non homologue

Polymérisation Ligation

PK est recrutée sur l’ADN, cela va permettre son activation et l’induction d’un changement de conformation pour mettre en contact les deux DNA-PKcs afin de former une synapse qui va maintenir la proximité des deux brins d’ADN. Puis la DNA-PKcs va s’autophosphoryler, notamment au niveau du cluster 2609-2647, induisant un nouveau changement de conformation qui va libérer les extrémités pour laisser l’accès aux enzymes de maturation si les extrémités ne sont pas compatibles. Il existe différentes enzymes de maturations, Artémis, PNK, APE 1, qui vont prendre en charge différentes extrémités. Par exemple, la polynucléotide kinase (PNK) va ajouter un groupement phosphate en 5’. Dans certains cas, les extrémités présentent un groupement 3’ phosphoglycolate qui doit être enlevé pour permettre la ligature, et cela peut être fait par la PNK, APE1 (apurinic/apyrimidinic endonuclease) ou par l’enzyme de maturation la plus connue Artemis qui permet aussi de cliver les extrémités formant une structure en hairpin (Weterings and Chen 2008). Puis si une étape de polymérisation est nécessaire, les ADN polymérases μ ou λ vont intervenir. Pour finir, un deuxième complexe, composé de la ligase IV et de XRCC4 va être recruté par le complexe Ku/DNA-PK/ADN, et va permettre la ligature des deux brins d’ADN (Costantini et al. 2007). Récemment, un nouveau facteur de la NHEJ a été découvert, c’est la protéine XLF (XRCC4 like Factor) ou Cernunnos, qui serait recruté par Ku au même moment que le complexe XRCC4/Ligase IV, et stimulerait la capacité de ligation de la ligase (Yano et al. 2008). Une fois la cassure réparée, le complexe DNA-PK va permettre la dissociation de la plateforme protéique grâce à une nouvelle phosphorylation de la DNA-PKcs : le complexe XRCC4/Ligase IV et la DNA-PKcs se détache de l’ADN et Ku migre le long du brin d’ADN (Meek et al. 2004; Costantini et al. 2007; Lieber 2008; Weterings and Chen 2008).

b. Les acteurs majeurs de la NHEJ

Les protéines centrales de la NHEJ sont aux nombres de sept : Ku70, Ku80, DNA-PKcs, Artémis, XRCC4, ligase IV et le dernier facteur découvert XLF/Cernunnos.