Régulations post-transcriptionnelles et post-traductionnelles de VAD1

Au cours des différentes expériences menées, plusieurs questions se sont posées : pourquoi est-il pour le moment impossible de détecter la protéine VAD1 dans des expériences de Western blot ? Comment expliquer la difficulté de détection de la protéine chimérique VAD1-GFP en microspcopie à fluorescence ? Du fait de l’implication de VAD1 dans les mécanismes de régulation de la mort cellulaire, il est possible que les transcrits correspondants au gène VAD1 ainsi que la protéine VAD1 subissent des régulations post- transcriptionnelles et post-traductionnelles, respectivement, de manière à réguler finement la fonction de la protéine VAD1 et la mort cellulaire.

II.1. Régulation de l’expression de VAD1

Les différentes expériences de traitement avec des molécules de signalisation et d’inoculation avec différentes souches d’agents pathogènes démontrent que le transcrit du gène VAD1 est induit faiblement. De plus, l’utilisation du promoteur constitutif 35S dans les expériences d’expression transitoire et dans les lignées transgéniques surexprimant VAD1 démontre que le transcrit VAD1 n’est pas détectable de manière constitutive. Cependant, les oligonucléotides utilisés dans ces expériences ne sont pas spécifiques de l’une ou l’autre forme putative des transcrits de VAD1, ceux-ci étant capables de se lier au niveau d’une partie commune entre les deux formes de transcrits. Même si les transcrits sont détectables

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dans les lignées transgéniques de manière plus importante que dans la lignée parentale sauvage au cours du développement, la quantité de ces transcrits est beaucoup plus importante au cours d’une interaction incompatible dans ces lignées transgéniques en comparaison avec la lignée parentale sauvage. Ces observations pourraient indiquer que les transcrits sont stabilisés au cours d’une interaction incompatible, et donc au cours de la mise en place de la HR. Il est donc envisageable que le gène VAD1 subisse une régulation post- transcriptionnelle permettant de stabiliser les transcrits de VAD1 au cours de la mise en place de la mort cellulaire.

L’une des régulations post-transcriptionnelles qui pourrait permettre de réguler l’accumulation des transcrits de VAD1 est l’existence de micro RNA (miRNA). Certains ARN sont la cible de tels miRNA. A l’heure actuelle, la recherche de miRNA dans la séquence nucléotidique de l’ADNc de VAD1 (http://microrna.sanger.ac.uk) n’a pas permis d’en mettre en évidence, ce qui signifie que cette régulation par un miRNA ne semble pas se mettre en place pour la régulation du transcrit VAD1.

D’autres régulations post-transcriptionnelles pourraient être mise en œuvre, comme la méthylation de l’ARN messager de VAD1, ou encore la régulation par des siRNA. Cette régulation par des siRNA pourrait être étudiée par des analyses d’expression de VAD1 dans des mutants de « silencing » affectés dans des composantes des complexes impliqués dans la dégradation de transcrits induite par les siRNA, comme par exemple les mutants dcl1,

dcl2, dcl3 et dcl4 (pour DiCer-Like) (Gasciolli et al., 2005 ; Xie et al., 2005). De plus, comme

décrit dans le paragraphe précédent, la présence putative de deux transcrits de taille différente pourrait indiquer l’existence d’un épissage alternatif régulant la fonction de VAD1.

II.2. Régulations post-traductionnelles : un rôle pour les

domaines PEST et pour la sumoylation ?

Des régulations post-transcriptionnelles pourraient exister au niveau de l’expression de

VAD1. Il est possible que des régulations post-traductionnelles se mettent en place afin de

réguler la durée de vie de la protéine VAD1, et donc sa fonction.

La séquence de la protéine VAD1 a été soumise à l’analyse par un logiciel permettant de déterminer la présence de régions de type PEST (Rogers et al., 1986 ; Rechsteiner et Rogers, 1996). La présence de ces motifs indique que la protéine VAD1 pourrait être une cible d’enzymes protéolytiques qui pourraient la cliver de manière à réguler sa durée de vie. Deux motifs à haute probabilié apparaissent sur la protéine VAD1 (Figure 47).

De plus, cette protéine a été soumise à une analyse permettant de détecter la présence de motifs permettant la sumoylation de la protéine et cinq motifs sont apparus comme putativement sumoylables, dont deux plus particulièrement (Figure 47). La sumoylation est

une réaction enzymatique permettant l’ajout sur la protéine de groupement SUMO au niveau de certains résidus lysines. Or, la sumoylation est une réaction qui peut entrer en compétition avec l’ubiquitination (Rechsteiner et Rogers, 1996), réaction enzymatique qui permet l’ajout de groupement ubiquitine au niveau de certains résidus de type lysine (Zeng

et al., 2006). Cette ubiquitination a pour conséquence l’adressage de la protéine vers le

protéasome qui dégrade la protéine cible et régule donc sa durée de vie.

La présence de motifs PEST et de sumoylation permet donc de penser que la durée de vie de VAD1 pourrait être finement régulée par l’une ou l’autre de ces réactions, et pourrait expliquer le fait que VAD1 ne soit plus détectable en Western Blot. Il est possible que, dans des conditions normales de développement de la plante, la protéine soit produite mais soit très vite dégradée. Du fait de sa fonction putative de régulateur négatif de la mort cellulaire, cette protéine ne serait pas nécessaire au cours du développement et ne serait pas produite et/ou serait dégradée très rapidement. Dans le cas de la mise en place de la mort cellulaire associée à la HR, la dégradation de la protéine par l’action d’enzymes protéolytiques au niveau des motifs PEST pourraient être inhibée, et la sumoylation pourraient être mise en place de manière à inhiber l’ubiquitination de la protéine, ce qui permettrait de sa

stabilisation. Ainsi, une fois stabilisée, la protéine pourrait exercer son rôle de régulateur négatif de la HR. Cependant, ces données ont été obtenues in silico et sont donc des données qui restent à être confirmées expérimentalement, notamment par la mutagenèse des différentes régions permettant les régulations post-traductionnelles putatives et par l’analyse de l’effet de ces mutations. Des constructions dans lesquelles les domaines PEST ont été mutés, sont en cours d’analyse par des expériences d’expression transitoire chez

Nicotiana benthamiana et par la génération de lignées transgéniques d’Arabidopsis.