Chapitre III : Vers la recherche de composantes des voies de signalisation
III. Partenaires de VAD1 dans le contrôle de la PCD
Dans le but d’identifier des partenaires de VAD1 dans la régulation de la mort cellulaire, une approche génétique visant à identifier des suppresseurs de la mutation vad1 a été entreprise et 31 suppresseurs ont été sélectionnés, répartis en quatre grandes classes phénotypiques.
III.1. Suppresseurs : composantes possibles des voies de
signalisation conduisant à la HR et à la résistance ?
L’une des hypothèses pouvant être émise quant à la nature des gènes altérés chez les doubles mutants vad1/svd est l’altération de composantes des voies de signalisation associées à la HR et à la résistance. En effet, des études d’épistasie entre des mutations affectant des composantes des voies SA et ET, et la mutation vad1 ont permis de démontrer
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que des mutations rendant les plantes insensibles à l’ET (mutants ein) et des mutations affectant la production de SA (mutants sid) inhibaient l’apparition des lésions chez le mutant
vad1 (Lorrain, 2004 ; Lorrain et al., 2004 ; Bouchez et al., 2007). Cependant, l’inhibition
n’est pas totale, quelques lésions apparaissant très tardivement chez ces doubles mutants, ce qui n’est pas observé chez les doubles mutants vad1/svd. Il est donc possible que les mutations svd affectent des composantes de ces voies, mais il est peu probable qu’elles affectent des composantes déjà testées. De manière à confirmer ou infirmer cette hypothèse, l’analyse de l’expression au cours d’une inoculation avec un agent pathogène avirulent de gènes marqueurs des voies de signalisation associées à la HR et à la défense permettra de déterminer si ces voies sont altérées chez les doubles mutants vad1/svd.
III.2. La HR n’est pas supprimée chez les doubles mutants
vad1/svd
Les analyses réalisées sur les cinq doubles mutants vad1/svd caractérisés génétiquement révèlent que ces doubles mutants sont toujours capables d’induire les mécanismes de mise en place de mort cellulaire associée à la HR en réponse à l’inoculation avec la souche avirulente PstDC3000/Avrpm1. De plus, la cinétique d’apparition des lésions ainsi que la résistance restent inchangées en comparaison avec la lignée parentale sauvage Ws-4. Ces mutations pourraient affecter des composantes participant seulement partiellement à la limitation de la HR dans le contexte du mutant vad1. Concernant l’hypothèse de la liaison entre VAD1 et le contrôle de la production/détoxification des ROS, il serait possible que ces mutations affectent par exemple des enzymes (ou des régulateurs) impliquées dans la production des ROS, ou dans la perception/régulation d’un signal de stress impliquant les ROS. Ainsi, chez le mutant vad1, une quantité de ROS suffisante serait produite pour induire les mécanismes de mort cellulaire spontanément. Dans le cas des doubles mutants
vad1/svd, il est possible que ce seuil ne soit pas atteint, si la mutation affecte la production
des ROS ou un récepteur/régulateur positif d’un signal de stress impliquant les ROS. Dans le cas de la mise en place de la HR, d’autres enzymes, inductibles, pourraient entrer en jeu dans la production des ROS et par conséquent, la production serait plus importante, ce qui permettrait d’atteindre un seuil qui induirait les mécanismes de mise en place de la HR. Ce modèle étend l’hypothèse d’un régulateur négatif spécifique de la mort cellulaire associée à la HR à un rôle de régulateur négatif de la mort cellulaire en général pour VAD1, en tout cas de la mort cellulaire ROS-dépendante, dans l’hypothèse considérée. En faveur de cette hypothèse, des données obtenues in silico et par l’utilisation du gène rapporteur GUS fusionné au promoteur de VAD1 semblent indiquer que VAD1 serait exprimé au cours de la sénescence des cotylédons et des feuilles, et également au niveau de tissus vasculaires, où
des mécanismes de mort cellulaire et la production de ROS sont observés. Il est donc possible que VAD1 joue un rôle général dans des mécanismes de mort cellulaire.
III.3. Mutation de type eds pour la lignée vad1/svd118 ?
L’une des lignées testée génétiquement, la lignée vad1/svd118, présente un phénotype développemental similaire à la lignée parentale sauvage Ws-4. L’analyse de cette lignée démontre qu’elle est toujours capable d’induire la mise en place de la HR, associée à la restriction de la croissance de la bactérie avirulente PstDC3000/AvrRpm1 comparable à celle du parent sauvage Ws-4. Cependant, seule la souche avirulente PstDC3000/AvrRpm1 a été testée et il serait nécessaire de tester d’autres souches avirulentes. D’autre part, l’analyse de la réponse de cette lignée à la bactérie virulente PstDC3000 démontre une augmentation de la sensibilité en comparaison avec le parent sauvage Ws-4. Il semble donc que cette lignée soit affectée spécifiquement dans la résistance contre des agents pathogènes virulents. Ces résultats permettent de penser que cette mutation pourraient affecter une composante impliquée dans la mise en place de la résistance basale, résistance mise en place par des agents pathogènes virulents et permettant de limiter le développement des symptômes de maladie. Des exemples d’identification et de caractérisation de tels mutants, affectés spécifiquement dans la résistance à des agents pathogènes virulents, mais toujours capable d’activer la HR, sont disponibles dans la littérature. En effet, les mutants de type eds (pour Enhanced Disease Susceptibility) sont des mutants présentant une augmentation de la sensibilité à la souche virulente Pseudomonas
syringae pv. maculicola (Psm) ES4326, et ceux-ci sont toujours capables de développer une
HR et de restreindre la croissance de la souche avirulente PsmES4326/AvrRpt2 (Glazebrook
et al., 1996 ; Rogers et Ausubel, 1997 ; Volko et al., 1998). La mutation svd118 pourrait
donc être une mutation de type eds, ces mutations affectant la mort cellulaire. Des croisements entre des mutants LMM et des mutants eds, comme eds1, eds5 (sid1) ou eds16 (sid2) (Clarke et al., 2001 ; Rusterucci et al., 2001 ; Lorrain et al., 2004) ont permis de démontrer l’implication de ces composantes EDS dans la mise en place de la mort cellulaire. Des expériences d’épistasie ont été réalisées entre la mutation vad1 et la mutation eds1, mutation affectant une composante des voies précoces de signalisation (Parker et al., 1996). Les résultats obtenus sur le double mutant vad1/eds1 démontre une modification des phénotype associés à la mutation vad1, le double mutant présente un fort retard dans l’apparition des lésions et dans l’accumulation des marqueurs de défense, et présente une taille intermédiaire entre le parent vad1 et le parent sauvage Ws-4 (Lorrain et al., 2004), phénotypes qui sont différents de la lignée vad1/svd118. Il est donc peu probable que la mutation svd118 soit un allèle de la mutation eds1. Les mutants eds sont aussi affectés dans l’expression du marqueur de défense PR-1 au cours d’une inoculation. De manière à affirmer
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ou infirmer l’hypothèse d’une mutation de type eds, il sera nécessaire d’une part, de déterminer l’accumulation des transcrits correspondant au gène PR-1 au cours d’une interaction compatible chez la lignée svd118, et d’autre part, de réaliser des tests d’allélisme avec les différents mutants eds disponibles.
III.4. Modification de la spécificité tissulaire des lésions
Différents groupes de suppresseurs de la mutation vad1 ont été identifiés. Un premier groupe est constitué de mutants développant spontanément des lésions, mais de manière différente du mutant vad1. La spécificité tissulaire, la nature ainsi que l’intensité des lésions sont différentes. Le mutant vad1 développe des lésions tissus-spécifiques au niveau des tissus péri-vasculaires. Certaines de ces lignées pourraient être affectées dans des composantes associées avec la mise en place des lésions au niveau de ces tissus péri- vasculaires. Ces composantes pourraient être des régulateurs positifs de la PCD au niveau de ces tissus. Ainsi, lorsqu’elles sont absentes, la mort cellulaire n’est plus activée au niveau de ces tissus au moment où elle est activée chez le mutant vad1. Ceci pourrait expliquer la mort cellulaire plus tardive chez les doubles mutants vad1/svd, et la mise en place de cette mort cellulaire dans d’autres tissus.
III.5. Découplage entre mort cellulaire et phénotype
développemental
Le mutant vad1 développe spontanément des lésions de type HR et présente une modification du phénotype au cours du développement en comparaison avec le parent sauvage Ws-4. Or, plusieurs suppresseurs de la mutation vad1 identifiés au cours de la thèse ne présentent pas d’apparition spontanée de lésions mais présentent toujours une modification du phénotype au cours du développement. Ceci indique qu’un découplage entre l’apparition de la mort cellulaire et le phénotype développemental observés chez le mutant
vad1 peut exister. Ces mutants sont potentiellement intéressants car ils permettent de
penser que les gènes affectés chez ces mutants codent des protéines qui pourraient être des régulateurs positifs spécifiques de la mise en place de la mort cellulaire, ou pourraient être des acteurs participant directement au processus de la mise en place de la mort cellulaire. Il sera nécessaire de déterminer si ces mutants sont toujours capables de mettre en place la mort cellulaire lors d’une inoculation avec un agent pathogène avirulent, et également de déterminer si d’autres mécanismes de mort cellulaire liés au développement sont affectés chez ces mutants. De plus, l’identification de tels mutants indique que le gène
VAD1 contrôle d’une part la mise en place de la mort cellulaire, et d’autre part des
mécanismes liés au développement. DISCUSSION/PERSPECTIVES
Une autre hypothèse peut être émise : la perturbation des voies de signalisation conduisant à la HR et à la résistance, notamment la surproduction de certaines hormones, se traduit par une modification du phénotype développemental des plantes. En effet, par exemple, la surproduction de l’ET ou l’activation constitutive de la voie ET induit des modifications du phénotype des plantes, observées entre autres chez les mutants eto2 et
ctr1 (Kieber et al., 1993 ; Chae et al., 2003). Le mutant vad1 présentant une accumulation
constitutive des hormones ET et SA, l’hypothèse d’un régulateur négatif de ces voies a été émise. L’identification de ces mutants, présentant une altération dans leur développement mais ne présentant pas de lésion, pourrait suggérer que VAD1 contrôle indépendamment la mort cellulaire et des voies de signalisation. Ces voies de signalisation pourraient être activées chez les doubles mutants vad1/svd ce qui se traduirait par une altération de leur développement, sans pour autant qu’ils développent des lésions. L’analyse de l’activation de ces voies dans les mutants permettra de répondre à cette question.